板藍根顆粒中2種關鍵抗病毒成分的含量分析

板藍根顆粒是由中藥板藍根(Isatis indigotica Fort.)經(jīng)水提、醇沉等工藝制備的中成藥產(chǎn)品，具 有清熱解毒、涼血利咽之功效，用于肺胃熱盛引 起的咽喉腫痛、口咽干燥，對急性扁桃體炎有很 好的治療效果。板藍根是國家重點推薦發(fā)展的品 種。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，板藍根具有抗病毒、降血脂、 降血糖、修復肝損傷和抗氧化等藥理作用，含 有生物堿、木質素、核苷類、有機酸、多糖等多 種藥效成分，其中(R,S)-告衣春為代表的生物堿 類成分和以直鐵線蓮寧B為代表的木質素類成分， 已被證明有明顯的抗病毒活性。

1 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國 Agilent 公 司)，色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 µm)；KQ-600VDB 型雙頻數(shù)超聲波自動清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)； MILLI-Q Direct 8 純水儀(美國密理博)；BT214D 型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公 司)；CP225D 型電子分析天平(德國賽多利斯)。 直鐵線蓮寧 B 對照品為實驗室從板藍根藥材 中分離純化得到的高純度單體，并經(jīng)過紫外光譜(UV)、質譜(MS)、核磁共振(NMR)等鑒定其結構， 利用 HPLC 峰面積歸一化法檢測其純度，純 度>99%；(R,S)-告衣春對照品(中國食品藥品檢定 研究院，批號：111753-201706；純度：100.0%)； 板藍根顆粒(白云山和記黃埔中藥有限公司，規(guī)格： 每袋 10 g；批號：D18F019，K18A010，K18A008)； 甲醇(分析純，廣州化學試劑廠)，甲醇(色譜純， 默克)；水為超純水。

2 方法與結果

采 用 Angilent ZORBAX SB-C18 色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 µm)；流動相為甲醇(A)-水(B)， 梯度洗脫(0~3 min，3%B；3~25 min，3%→10%B； 25~27 min，10%→25%B；27~45 min，25%B；45~ 50 min，90%B)；流速 0.8 mL·min?1 ；紫外檢測器， 波長 224 nm；柱溫 30 ℃；進樣量 10 µL。取直鐵線蓮寧 B 對照 品，精密稱定，加 50%甲醇制成每 1 mL 含 31.8 µg 的溶液，即得。取(R,S)-告衣春對照品，精密稱定， 加 5%甲醇制成每 1 mL 含 23.9 µg 的溶液，即得。 2.2.2 供試品溶液的制備 取板藍根顆粒適量， 研細，精密稱定 1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入 5%甲醇 10 mL，稱定質量，超聲提取 5 min，再用 相同濃度的甲醇補足丟失質量后，過濾，取續(xù)濾 液 25 mL，過 0.45 µm 微孔濾膜，即得。用稀釋倍數(shù)法制成含(R,S)- 告衣春 2.39，4.78，11.95，23.90，35.85，47.80 μg·mL?? 和含直鐵線蓮寧 B 3.18，6.36，15.90，31.80，47.70， 63.60 μg·mL??的混合對照溶液。分別精密吸取系 列濃度的對照品溶液 10 µL，按照“2.1”項下色譜 條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(y)，對照品濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線，并進行線 性回歸。結果表明，(R,S)-告衣春和直鐵線蓮寧 B 在各自的濃度范圍內，呈良好線性關系。

3 討論

用 DAD 檢測器對(R,S)-告衣春和直鐵線蓮寧 B 對照品溶液在 190~400 nm 進行紫外掃描發(fā)現(xiàn)， (R,S)-告衣春在 240 nm 處有最大吸收，直鐵線蓮寧 B 在 224 nm 和 276 nm 處有最大吸收。為同時實 現(xiàn) 2 個指標成分的準確定量，本實驗考察了 230， 254，280 nm 等檢測波長對定量結果的影響，發(fā)現(xiàn) 230 nm 處 2 個指標成分均有較高的響應值，且基 線穩(wěn)定，干擾較小。故選擇 230 nm 為檢測波長。本實驗考察了回流提取、超聲提取對提取率 的影響，發(fā)現(xiàn)兩者提取率相近，從操作簡便考慮， 選擇超聲提取；考察了提取溶劑水、5%甲醇、10% 甲醇、20%甲醇、50%甲醇對提取率的影響，發(fā)現(xiàn) 無明顯差別，但部分樣品的水提取液不易通過微 孔濾膜(已考察了 0.22 µm 和 0.45 µm 的聚醚砜、 聚丙烯、尼龍微孔濾膜)，推測可能是水提液中某 些黏性成分造成的，亦或是某些樣品中輔料成分 帶來的影響；同時考察了 60，30，10，5 min 不同 提取時間對提取率的影響，發(fā)現(xiàn)沒有明顯差別， 也考察了 5 min 內的提取效果，發(fā)現(xiàn)結果明顯偏低 且無規(guī)律性，推測可能是因提取不充分造成。因 此，從操作簡便快捷、經(jīng)濟環(huán)保、結果穩(wěn)定可靠 的角度考慮，選擇 5%甲醇超聲提取 5 min。