雌二醇電化學(xué)適配體傳感器探討-KQ-100DB使用

17β-雌二醇( 17β-Estradiol，E2) 是常見(jiàn)的內(nèi)分泌干擾物之一，環(huán)境中存在的 E2 可直接或間接進(jìn)入 生物體，具有致癌致畸效應(yīng)． 因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、靈敏和高選擇性的 E2 檢測(cè)技術(shù)十分必要． 傳統(tǒng)的 E2 檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和電化學(xué)方法等． 這些檢測(cè)方法或需要精密儀器，或檢測(cè)步驟繁瑣，而且電化學(xué)方法直接測(cè)定 E2 的靈敏度和選擇性還 有待提高．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試劑與儀器

17β-雌二醇( E2) 、雌三醇( E3) 、雙酚 A( BPA) 和對(duì)苯二酚( HQ) 均為分析純，購(gòu)于北京百靈威科技有限公司; 氯金酸( HAuCl4·4H2O，分析純) 和硫堇( THI，分析純) 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司; 納米二硫化鉬分散液( MoS2，分析純) 購(gòu)于南京牧科納米科技有限公司; 17β-雌二醇適配體 ( 17β-Estradiol aptamer DNA) 和部分互補(bǔ)單鏈 DNA( cDNA) 經(jīng)高效液相色譜( HPLC) 純化，由生工生物 工程( 上海) 股份有限公司合成，其堿基序列分別為 Aptamer DNA 5'-SH-( CH2 ) 6-GCT TCC AGC TTA TTG AAT TAC ACG CAG AGG GTA GCG GCT CTG CGC ATT CAA TTG CTG CGC GCT GAA GCG CGG AAG C 和 cDNA 5'-SH-( CH2 ) 6-TTT GAG CTT CCG CGC TTC AGC GCG CAG CAA; 實(shí)驗(yàn)用水為超純水． CHI660E 型電化學(xué)工作站( 上海辰華儀器公司) ，實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng): 二硫化鉬/納米金修飾玻 碳電極( GNPs-MoS2 /GCE) 為工作電極，飽和甘汞電極( SCE) 為參比電極，鉑片電極為對(duì)電極; SU8220 型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡( SEM，日本 Hitachi 公司) ; UV-2550 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)( 日本島津公 司) ; 昆山舒美KQ-100DB 超聲波清洗機(jī)( 江蘇昆山超聲儀器公司) ．

1．2 電化學(xué)適配體傳感器的制備及測(cè)定

參考方法合成納米金溶膠( GNPs) ，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)表征 GNPs 的特征吸收峰為 519 nm． 參照方法進(jìn)行玻碳電極( GCE) 的預(yù)處理． 電化學(xué)適配體傳感器的制備及原理如 Scheme 1所示． 參照方法制備 GNPs-MoS2 修飾電極: 將 1 mg /mL MoS2 溶液超聲分散 2 h，取 5 μL滴涂于預(yù)處理好的 GCE 表面，室溫下自然晾干． 將 MoS2 修飾電極置于含 6 mmol /L 氯金酸的 0. 1 mol /L KCl 溶液中，在－0. 2 V( vs． SCE) 恒電位條件下沉積 80 s，即得到 GNPs-MoS2 修飾電極． 將 5 μL 1. 0×10－6 mol /L 適配體 DNA 滴涂到修飾電極表面，于 4 ℃ 冰箱中放置 12 h，分別用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl( pH = 7. 4) 緩沖溶液沖洗吸附的適配體 DNA． 為了防止非特異性吸附，將電極浸泡 于1 mg /mL的牛血清白蛋白( BSA) 溶液中，于 38 ℃放置 1 h 后，用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖 溶液( pH = 7. 4) 沖洗表面，再與 1. 0×10－6 mol /L 部分互補(bǔ) cDNA 于 38 ℃雜交反應(yīng) 70 min． 在雜交后的 電極表面滴加 9 μL 合成的 GNPs，室溫下避光靜置 4 h; 再置于 0. 25 mmol /L 的 THI 溶液中避光靜置 50 min后，用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖溶液( pH = 7. 4) 沖洗以除去未吸附的 GNPs 和 THI，獲 得適配 體 傳 感 器 ( THI-GNPs / dsDNA /BSA / ssDNA /GNPs-MoS2 /GCE) ． 在 5 mmol /L K3［Fe ( CN) 6］/ 5 mmol /L K4［Fe( CN) 6］/10 mmol /L KCl 溶液中，采用循環(huán)伏安( CV) 法和電化學(xué)交流阻抗( EIS) 法對(duì) 傳感器進(jìn)行表征．

室溫下，將制備的傳感器置于不同濃度的 E2 溶液中反應(yīng) 50 min，反應(yīng)結(jié)束后用超純水和 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖溶液( pH = 7. 4) 沖洗電極表面，然后置于 0. 01 mol /L Tris-HCl 緩沖溶液( pH = 7. 4) 中，采用差分脈沖伏安( DPV) 法對(duì) E2 進(jìn)行定量測(cè)定，記錄 THI 的氧化峰電流，用反應(yīng)前后目標(biāo)物 E2 的 ΔI［ΔI = I0－I) ［其中，I0( μA) 為反應(yīng)初始電流; I( μA) 為反應(yīng)后的電流，ΔI( μA) 為反應(yīng)前后的電流 變化］進(jìn)行定量分析．

2 結(jié)果與討論

圖 1 為 MoS2 /GCE 和 GNPs-MoS2 /GCE 的 SEM 照片和能譜分析( EDS) 圖． 由圖 1( A) 可知，納米 MoS2 呈層狀薄片分布，片層之間有孔道． 由圖 1( B) 可見(jiàn)，20 ～ 30 nm 的顆粒物分布在 MoS2 層狀薄片 上，表明 GNPs 已制備． 在圖 1( C) 中可以觀察到 Mo，S，C 和 O 的峰，在圖 1( D) 可以觀察到 Au，Mo， S，C 和 O 的峰，其中 C 和 O 為 GCE 電極的基體元素，Mo 和 S 峰為 MoS2 的峰． 而 Au 峰的存在進(jìn)一步 證明 MoS2 表面分布的顆粒物為 GNPs．

THI 具有良好的電化學(xué)氧化還原可逆性和穩(wěn)定性，近年來(lái)被作為電化學(xué)免疫傳感器和電化學(xué) DNA 傳感器的電化學(xué)指示劑． GNPs 作為信號(hào)物質(zhì)載體，可與 THI 分子形成金-硫、金-氮鍵合作用及 Fig．3 CV response of the electrochemical aptasensor interacted with different concentrations of E2 in 0. 01 mol /L Tris-HCl solution ( pH= 7. 4) cE2 /( mol·L－1 ) : a． 0; b． 1. 0×10－13 ; c． 1. 0×10－12 ． 靜電吸附作用，從而制備 GNPs /THI 電化學(xué)指示 劑; GNPs 的大比表面積為 THI 提供了大量結(jié)合位 點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的放大．

3 結(jié) 論

基于雙信號(hào)放大建立了電化學(xué)適配體傳感器檢測(cè) E2 的分析方法． 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測(cè) E2 的檢出限為 4. 2×10－15 mol /L( S /N= 3) ． 該方法檢出限較低、線(xiàn)性范圍較寬、特異性較好，可用于環(huán)境 水樣中 E2 的檢測(cè)，并有望用于其它環(huán)境樣品中 E2 的測(cè)定．



 

免責(zé)聲明：文章僅供學(xué)習(xí)和交流，如涉及作品版權(quán)問(wèn)題需要我方刪除，請(qǐng)聯(lián)系我們，我們會(huì)在第一時(shí)間進(jìn)行處理。