技術(shù)分析不同劑型扶正方的差異化學(xué)成分(KQ-500

中醫(yī)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與邪正盛衰，陰陽氣血津 液失調(diào)等因素密切相關(guān)，正氣不足是腫瘤發(fā)生的前 提條件，邪氣距之是腫瘤發(fā)生的重要原因，針對腫 瘤患者的臨床表現(xiàn)，顧及手術(shù)、放化療對人體的損 害，我院臨床醫(yī)生提出以扶正和祛邪為兩大基本原則，總結(jié)出以太子參、茯苓、陳皮、甘草等 12 味中藥 組成的協(xié)定處方“扶正方”。

1 材料

1． 1 儀器

Ultimate 3000 HPLC 高效液相色譜儀 ( 美國 Thermo Fisher Scientific 公司) ; Q-Exactive Orbitrap /MS 四級(jí)桿軌道阱質(zhì)譜( 美國 Thermo Fisher Scientific 公司) ; Compound Discovereru 處理軟件( 美 國 Thermo Fisher Scientific 公司) ; SIMCA-P 13． 0 多 元統(tǒng)計(jì)分析軟件( 瑞典 Umetrics 公司) ; Anke TGL16B 離心機(jī)( 上海安亭科學(xué)儀器公司) ; BSA224S 電 子天平( 德國 Sartorius 公司) ; 昆山舒美KQ-500B 型超聲波清 洗器( 昆山市超聲儀器有限公司) 。

1． 2 試藥

乙 腈、甲 醇、超 純 水( 德 國 Merck 公 司) ; 甲酸、L-2-氯苯丙胺酸( 美國 Sigma-Aldrich 公 司) 。收集“扶正方”傳統(tǒng)中藥飲片( 蘇州天靈中藥 飲片有限公司，批號(hào) 190120010) 和配方顆粒( 江陰 天江藥業(yè)有限公司，批號(hào) 18120411) 樣品各 5 份。 所有樣品均由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為各自種屬藥材，留樣憑證保存于江南大學(xué)附 屬醫(yī)院( 無錫市第四人民醫(yī)院) 中藥房。

2 方法

2． 1 供試品溶液的制備

傳統(tǒng)扶正方中藥飲片: 按扶正方配伍量( 太子參、茯苓、南沙參、北沙參、麥 冬、天花粉、生白術(shù)、生黃精、酒女貞子、淫羊藿均為 10 g、陳皮 6 g、甘草 3 g) ，精密稱取飲片，加 8 倍量 的蒸餾水浸泡 30 min，武火煮沸后改文火再煎 20 min，趁熱濾出藥液，藥渣再加相當(dāng)藥材量 6 倍量的 蒸餾水，煮沸后文火再煎煮 30 min，濾過，合并濾液， 蒸干。殘?jiān)尤?800 μL 甲醇和 10 μL 內(nèi)標(biāo)( 2． 8 mg ·mL － 1，二氯苯丙氨酸) ，置于組織研磨儀中 65 Hz 研磨 90 s，隨后 40 kHz 冰浴超聲 30 min，在 － 20 ℃ 下靜置1 h，以12 000 r·min － 1離心15 min( 置于4 ℃ 離心機(jī)中) ，取上清液，過 0． 22 μm 微孔濾膜，即得。 扶正方配方顆粒: 按扶正方配伍量( 太子參 1． 5 g、茯苓 1 g、陳皮 1 g、南沙參 2 g、北沙參 2 g、麥冬 3 g、天花粉 1 g、甘草 0． 5 g、生白術(shù) 3 g、生黃精 4 g、酒 女貞子 1 g、淫羊藿 0． 5 g) ，精密稱取各配方顆粒，混 合均勻，加適量沸水溶解后稀釋至與傳統(tǒng)扶正方中 藥飲片水煎液相同體積，之后制備方法同上。

2． 2 測定條件

色譜條件: 色譜柱: Hyper gold C18 色譜柱( 100 mm × 2． 1 mm × 1． 9 μm) ; 流動(dòng)相: 水 + 5% 乙腈 + 0． 1% 甲酸( A) 和乙腈 + 0． 1% 甲酸( B) ; 梯度洗脫程序: 0 ～ 1． 5 min( 100% ～ 80% A) ，1． 5 ～ 9． 5 min( 80% ～ 0% A) ，9． 5 ～ 14． 5( 0% ～ 0% A) ， 14． 5 ～ 14． 6 ( 0% ～ 100% A) ，14． 6 ～ 18 ( 100% ～ 100% A) ; 流速 0． 35 mL·min － 1 ; 柱溫 40 ℃ ; 進(jìn)樣量 10 μL。 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源( ESI) ，在正離子模式 下數(shù)據(jù)采集范圍 m / z 50 ～ 1 000，加熱器溫度 300 ℃ ; 鞘氣流速: 45 arb; 輔助氣流速: 15 arb; 尾氣流 速: 1 arb; 電噴霧電壓: 3． 0 kV; 毛細(xì)管溫度: 350 ℃ ; S-Lens ＲF Level，30% 。在負(fù)離子模式下數(shù)據(jù)采集 范圍 m / z 50 ～ 1 100，加熱器溫度 300 ℃ ; 鞘氣流速: 45 arb; 輔助氣流速: 15 arb; 尾氣流速: 1 arb; 電噴霧 電 壓: 3． 2 kV; 毛 細(xì) 管 溫 度: 350 ℃ ; S-Lens ＲF Level，60% 。

2． 3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用 Compound Discoverer 軟件對 LC /MS 檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和預(yù)處理， 并在 Excel 2010 中對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化及后期編輯， 最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，包含保留時(shí)間、分 子量、峰強(qiáng)度等信息。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入 SIMCA-P 13． 0 軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用 PCA分析通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達(dá) 不同劑型扶正方之間的化學(xué)組成差異; 隨后采用 PLS-DA 和 OPLS-DA 進(jìn)一步對樣品進(jìn)行分類，其中 判別模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)為 Ｒ2 Y( 該值為模型 的解釋率) 及 Q2 值( 該值為模型的預(yù)測率) ，Ｒ2 Y 越 接近 1，表示模型越穩(wěn)定，Q2 ＞ 0． 5 表示預(yù)測率高。 根據(jù) OPLS-DA 模型的常用變量載荷評(píng)價(jià)參數(shù) ( VIP) ( VIP ＞ 1) ，并結(jié)合 t-test 的 P 值( P ＜ 0． 05) 來 尋找差異性表達(dá)代謝物。

3 結(jié)果

采用的 PCA 多變量模式識(shí)別方 法對傳統(tǒng)中藥飲片和配方顆粒扶正方進(jìn)行降維分 析。不同劑型扶正方在質(zhì)譜正、負(fù)離子模式下 PCA 得分散點(diǎn)圖，見圖 2 ( 正離子模式下，Ｒ2 X = 0． 824， Q2 = 0． 633; 負(fù)離子模式下，Ｒ2 X = 0． 811，Q2 = 0． 661) 。結(jié)果顯示在正、負(fù)離子模式下，不同劑型扶 正方之間均具有很好的區(qū)分度，這表明傳統(tǒng)中藥飲 片和配方顆粒扶正方的化學(xué)成分存在明顯差異。通過排列試驗(yàn)隨機(jī)多次( n = 200) 改變分 類變量 y 的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)。從圖 3b 和 3d 可見，PLS-DA 模型排列實(shí)驗(yàn)中左端隨機(jī)排 列產(chǎn)生的 Ｒ2 和 Q2 值均小于右端的原始值，表明原 始模型的預(yù)測能力大于隨機(jī)排列 y 變量的預(yù)測能 力，即模型有效，可以進(jìn)行后續(xù)的差異成分分析。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)供試品溶液制備分別考察了 100% 甲醇、 70%甲醇、50% 甲醇、30% 甲醇 4 種溶劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的影響，同時(shí)考察了 15，30，45，60，75 min 超聲提取時(shí) 間，結(jié)果表明，以100%甲醇作為溶劑的色譜峰形最優(yōu) 且超聲提取 30 min 的相對峰面積最大。因此，最終 選擇這種樣品處理方法。流動(dòng)相的選擇分別考察了 甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0． 1% 甲酸水、乙腈-0． 1% 甲酸水、乙腈 + 0． 1% 甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸、5% 乙 腈 + 0． 1%甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸，結(jié)果表明 5% 乙 腈 + 0． 1%甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸的峰形較好且分 離度較高，因此將其確定為流動(dòng)相。



 

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