昆山舒美測定雙黃連可溶性粉中3個成分的含量

雙黃連可溶性粉質量標準收載于《獸藥質量標準》2017 年版（中藥卷）非處方藥，由金銀花、黃芩、連翹 3 味中藥 組成，獸醫臨床用于預防和治療畜禽外感風寒所致的上呼 吸道感染、急性支氣管炎、急性扁桃腺炎和輕度肺炎等。 現行標準中僅有黃芩中黃芩苷的含量測定，但中藥復方具 有多成分、多功效的作用特點，測定單味中藥成分難以表 達中藥復方的整體質量。在相關文獻的基礎上，筆者等 以這 3 種藥材的代表性成分為檢測指標，采用 HPLC 波長 切換法對制劑中金銀花、黃芩、連翹的 3 個特征性成分綠原 酸、連翹苷、黃芩苷進行含量測定，該方法簡便，分離度好， 結果準確，適用于雙黃連可溶性粉的產品質量控制分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000 戴安高效液相色譜儀，戴安二極管陣列檢測 器；Mettler XS105 十萬分之一天平（梅特勒公司）；Sartorius BP211D 電子分析天平 （德國賽多利斯）；KQ－500E 型超 聲 波清洗器 （昆山舒美超聲儀器有限公司）；手動移液器 （Eppendorf，德國）。

1.2 試藥

對照品綠原酸（批號：Z0261702，規格：98.3%）購自中國獸醫藥品監察所；連翹苷（批號：11082-200615，規格：94.9%） 購自中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷（批號：Z0271514，規 格：95.9%）購自中國獸醫藥品監察所；甲醇（色譜純級）購自 德國 Merck 公司；水為超純水；磷酸為分析純；雙黃連可溶性 粉由安徽省相關獸藥企業提供，分別為 A 企業 （批號： 20181011）、B 企 業 （批 號 ：20180625）、C 企 業 （批 號 ： 20180712）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性試驗

采用 Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 流動相為甲醇（A）-0.1% 磷酸水溶液（B），按表 1 程序進 行梯度洗脫，流速 1 mL/min，檢測波長分別為 326 nm （0 ～26 min，測定綠原酸）、230 nm（44～48 min，測 定 連 翹 苷）、277 nm（48～53 min，測定黃芩苷），柱溫 30 ℃，進樣 量 10 μL。在上述色譜條件下，3 種待測成分與鄰近組分滿 足分離條件，各對照品的理論塔板數均大于 3 000。色譜 圖及光譜圖見圖 1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液

精密稱取原酸、連翹苷、黃芩苷的 對照品適量，分別加甲醇配制成每 1 mL 含綠原酸 4.53 mg、 連翹苷 2.78 mg、黃芩苷 28.52 mg 的對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液

精密吸取綠原酸對照品儲備液 1 000 μL，連翹苷對照品儲備液 1 000 μL，黃芩苷對照品 儲備液 1 000 μL，置 5 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻 度，搖勻，得濃度為綠原酸 45.3 μg/mL，連翹苷 27.8 μg/mL， 黃芩苷 219.0 μg/mL 的混合對照品溶液，冷藏，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

取雙黃連可溶性粉研細的粉 末 0.5 g，精密稱定，置 50 mL 的容量瓶中，加 50%甲醇適 量，超聲提取（功率 250 W，頻率 40 kHz）20 min，冷卻至 室溫，加 50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾 液 5 mL，置 10 mL 量瓶中，加 50%甲醇稀釋至刻度，搖 勻，即得。 2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按工藝方法分別制備缺少金銀花、連翹和黃芩的陰性樣品，并按“2.2”項下的方法， 制得陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及缺金銀花、 缺連翹、缺黃芩的陰性對照溶液各 10 μL，在上述色譜條 件下分別注入色譜儀，雙黃連可溶性粉在與綠原酸、連翹 苷、黃芩苷對照品相應的位置上均有相同保留時間的色譜 峰，而缺金銀花的陰性對照溶液無綠原酸色譜峰，缺連翹 的陰性對照溶液中無連翹苷色譜峰，缺黃芩的陰性對照溶 液無黃芩苷色譜峰，說明雙黃連可溶性對各成分的測定不 產生干擾。

3 討論

在處理樣品的溶劑選擇上，分別選擇 50%甲醇、75% 甲醇、純甲醇以及不同比例的乙醇溶液進行樣品處理，試 驗結果顯示，50%甲醇提取的雙黃連可溶性粉中的 3 種成 分的響應值最高。同時，分別選擇超聲、回流 2 種提取方法 進行樣品處理，結果顯示超聲提取效率最高，并且簡便快 捷。在超聲提取時間上，分別選擇 10 min、15 min、20 min、 30 min、45 min 對雙黃連可溶性粉進行超聲提取，試驗結 果顯示樣品在超聲 20 min 提取效率達到最高，20 min 后 的超聲提取對試驗結果值影響不顯著。因此，選擇用 50%甲醇超聲 20 min 提取效果最佳。中藥成分復雜而呈多樣性，本文采用二極管陣列檢測 器在 200~400 nm 范圍內對 3 種成分進行光譜掃描，結果 顯示綠原酸、連翹苷、黃芩苷的光譜圖存在一定差別，用同 一波長下同時檢測 3 種成分，難以獲得理想的靈敏度，筆 者參考有關文獻利用二極管陣列檢測器的全波長掃描功 能和波長切換功能，掃描綠原酸、連翹苷、黃芩苷這 3 種成 分在 200～400 nm 波長范圍內的光譜圖譜，同時結合流動 相的梯度洗脫將這 3 種成分進行分離，通過樣品的光譜和 色譜信息將波長設定為 0～26 min 時 326 nm （測定綠原 酸），40～43 min 時 230 nm （ 測定連翹苷），43～46 min 時 277 nm （測定黃芩苷）。運用本方法分別在各組分的出峰 時間段選擇相應的最大吸收波長作為檢測波長，提高了檢 測的靈敏度，實現了 3 個待測成分含量的同時測定。