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WD40 是真核生物中普遍存在的一個超基因轉 錄因子家族，它們在結構上包一個或幾個高度保守 的 WD 型結構域，也因此被稱為 WD40 重復蛋白 （WDR）。最初 WD40 轉錄因子被認為是 G 蛋白 β 亞基受體，該結構域包括 43 個氨基酸殘基，N 末端 為甘氨酸-組氨酸二肽（GH）結構，C 末端為典型 的色氨酸-天冬氨酸二肽結構（WD），攜帶該基序的蛋白稱為 WD40 蛋白。
本研究使用的“吉紅一號”紅花品種購自新疆塔 城，由吉林農業大學生物反應器工程中心保存，并種 植于人工氣候室，待進入花期后，分別于花蕾期、初 花期、盛花期、衰落期時間點收集花瓣組織，以花蕾 期花瓣作為對照，同時收集根、莖、葉材料進行組織 特異性表達分析。全部材料均液氮速凍，至于−80 ℃ 超低溫冰箱內長期保存。對照品羥基紅花黃色素 A （hydroxysafflor yellow A，HSYA），批號111637-200905， 購自森貝伽有限公司，質量分數大于 98%。
Invitrogen TRIzol 試劑（賽默飛世爾有限公司）； PrimerScript RT reagent kit 試劑盒、SYBR Advantage qPCR premix 試劑盒（寶生物工程有限公司）；T-easy 載體（全式金生物有限公司）；KQ-100 型超聲波儀器 （昆山舒美有限公司）。
將收集紅花花瓣等組織液氮內充分研磨，取 100 mg 植物材料置于無 RNA 酶 的 1.5 mL Eppendorf 離心管內，使用 Invitrogen TRIzol 試劑并 參照說明書進行總 RNA 提取。將獲得的總 RNA 用 DEPC 水溶解，NanoDrop2000 測定 260 nm 下總 RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。
利用 PrimerScript RT reagent kit 試劑盒將紅花 盛花期花瓣組織總 RNA 逆轉錄成 cDNA。根據紅 花花瓣轉錄組數據（SRA 數據庫登錄號 047279.2） 中 WD40 候選基因為參照，根據 CDS 序列設計合 成引物序列分別為上游：（5’-ATGCCAAACACGCTCGTCATAG-3’）和下游：（5’-TCATTCACCGTCGTCAGATACA-3’），產物長度為 1 053 bp。PCR 擴 增條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環 35 次，最后 72 ℃、5 min。將擴增的 DNA 片段克隆到 T-easy 載體上，挑選陽性克隆進行測序。
CtWD40 基因序列測序后去除載 體序列，提交 NCBI 數據庫進行 BLASTN 和 BLASTX 比對分析，搜索同源核酸序列及蛋白質序 列。使用 DNAMAN、Swiss-Model 工具進行蛋白結 構域及高級結構預測分析。
根據CtWD40 基因克隆測序 結果，推測編碼氨基酸序列，使用 GenBank BLASTX 利用 Nr 數據庫進行比對分析，搜索相似 度較高的不同物種WD40蛋白序列，利用MEGA 6.0 進行氨基酸序列進化分析，使用鄰接法 （neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹。
為研究CtWD40 基因在紅花不同組織中的表達 模式，以 18 S rRNA 為內參基因，利用實時熒光定 量 PCR 技術分別檢測 CtWD40 在根、莖、葉片、 花蕾期花瓣、初花期花瓣、盛花期花瓣、衰落期花 瓣中轉錄水平差異。按“2.1”項方法提取上述材料 總 RNA 后，使用 PrimerScript RT reagent kit 試劑盒 合成 cDNA；使用 SYBR Advantage qPCR premix 試 劑盒對基因進行表達分析鑒定。CtWD40 熒光定量 PCR 基因引物分別為上游： 5’-TCGTTTGAGCCCGGTATTGTTA-3’；下游：5’-TGCAAGAGAGAGAAGGCCAA-3’。18 S rRNA 熒光定量 PCR 基因引物分別為上游：5’-GAGAAACGGCTACCACATCCAA-3’和下游：5’-TCGTTTGAGCCCGGTATTGTTA-3’，擴增產物長度為 120 bp，生物學重復 次數為 3 次。使用 Mx3000 熒光定量 PCR 儀器（羅 氏）進行擴增，反應條件如下：使用 2 步法，95 ℃ 預變性 5 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火延伸 30 s， 循環 40 次。
通過 PCR 方法擴增獲得長度為 1 053 bp 的 CtWD40 基因片段。測序結果表明獲得的 cDNA 片段具有 1 個完整的編碼框，可編碼 350 個氨基酸殘基。使用 DNA MAN 軟件對紅花 CtWD40 等8個WD40氨基酸序列進行多重氨基酸序列比對分 析，結果鑒定到 8 個位于 WD 結構域位于 WD40 氨 基酸保守區序列內部（圖3）。氨基酸殘基長度分布2～ 9 個，氨基酸序列結構特征為 WD 或 W（X）nD。同源模建法分析 CtWD40 蛋白高級結構，結果發現該蛋 白質具有明顯的主鏈和環區結構。氨基酸序列相似性分析在蛋白進化研究中至 關重要。為研究紅花 WD40 轉錄因子的進化關系， 利用 MEGA 6.0 軟件使用 NJ 法對紅花、山杏、草 莓、馬鈴薯等共 19 個 WD40 蛋白序列進行系統發 育分析，系統進化樹構建結果。研究結果發 現，蛋白親緣關系較近的種屬在進化樹上距離最 近。紅花、向日葵、萵筍 3 個 WD40 轉錄因子聚在 同一個進化枝上，具有較近親緣關系。紅花、向日 葵、萵筍均為菊科植物，紅花 WD40 與萵筍 WD40 親緣關系最近。此外，茄科植物煙草、馬鈴薯、番 茄、潘那利番茄 WD40 轉錄因子集中分布在另一個 進化枝上，說明其親緣關系較近。HSYA 在不同時間花瓣中含量呈現先升高后 降低趨勢，盛花期花瓣中質量分數最高， 為（47.59±0.01）mg/g，在花蕾期、初花期及衰落 期質量分數分別為（28.48±0.01）、（38.16±0.01）、 （28.74±0.01）mg/g。分析 CtWD40 基因表達水平與 HSYA 含量的相關性，皮爾森相關系數為 0.936（P＝ 0.020），說明 CtWD40 在紅花不同花期花瓣中基因表達 水平與HSYA 量具有相關性。
作為植物中廣泛存在的超轉錄因子家族，WD40 轉錄因子家族成員在擬南芥、水稻、谷類中的陸續發 現揭示了其在植物中功能調控的多樣性。WD40 轉錄 因子通過介導蛋白質相互作用的方式參與一系列生 物過程，包括次生代謝化合物合成、植物器官形態建 設、組織分化等。尤其在黃酮代謝途徑研究中，多項 研究結果均揭示 WD40 轉錄因子與 MYB、bHLH 互 作后調控黃酮及類黃酮化合物的生物合成過程。本研 究首次克隆并鑒定了紅花 CtWD40 轉錄因子基因，該 轉錄因子具有 8 個典型的 WD 保守結構域，確保了 WD40 蛋白在生物過程中的功能行使。
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