KQ5200B對(duì)大鼠體內(nèi)組織中的分布行為的應(yīng)用

氟噻草胺屬芳氧乙酰胺類除草劑，主要用于玉米、大豆、向日葵等作物 上，適用于多數(shù)一年生禾本科雜草以及一些闊葉 雜草的防除，其作用機(jī)制為阻止雜草細(xì)胞的分 裂，抑制其生長(zhǎng)。氟噻草胺具有選擇性高、毒性 低、作用范圍廣以及合成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前， 對(duì)氟噻草胺的研究多集中于其藥效上，而對(duì)其 在環(huán)境中的殘留檢測(cè)相對(duì)較少，未見其在大鼠 體內(nèi)組織中分布行為的報(bào)道，而相關(guān)研究對(duì)于農(nóng) 藥研發(fā)、毒性作用機(jī)制研究、毒物的安全性評(píng)價(jià) 以及中毒解救都有重要意義。鑒于此，本研究擬 建立大鼠組織中氟噻草胺的 LC-MS/MS 分析方 法，并采用該方法對(duì)氟噻草胺灌胃給藥后在大 鼠體內(nèi)各組織中的分布行為進(jìn)行研究，旨在為其 毒性安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

LC-20A 高效液相色譜系統(tǒng) (日本 Shimadzu 公司)；API 3200 質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備 Analyst 1.5.1 操 作軟件和 LightSight 2.3 軟件 (美國(guó) AB Sciex 公 司)；Sartorius BSA3233S 電子天平 [ 賽多利斯科學(xué) 儀器 (北京) 有限公司 ]；Milli-Q 超純水機(jī) (美國(guó) Millipore 公司)；KQ5200B 型超聲清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；Sigma 3K15 高速離心機(jī) (美 國(guó) Sigma 公司)；QT-1 渦旋振蕩器 (上海琪特分析 儀器有限公司)；T18 basic 新型高速分散機(jī) (德國(guó) IKA 公司)。 氟噻草胺 (flufenacet，純度 > 98%) 和啶氧菌 酯 (picoxystrobin，內(nèi)標(biāo)，純度 > 98%) 標(biāo)準(zhǔn)品 (沈 陽(yáng)化工研究院有限公司)。乙腈 (色譜純，美國(guó) Fisher Scientific 公司)；甲酸 (色譜純，上海阿拉丁 公司)；CO2 /O2 (麻醉用)；超純水 (自制)。

雄性 SD 大鼠由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提 供，許可證號(hào)：SCXK (遼) 2015-0001。動(dòng)物室溫 度 19~26 ℃，空氣相對(duì)濕度 40%~70%，光照條件 為 150~300 lx (光照/黑暗各 12 h)，噪音在 60 dB 以下。動(dòng)物的使用經(jīng)沈陽(yáng)化工研究院有限公司安 全評(píng)價(jià)中心倫理委員會(huì)審批通過。動(dòng)物飼料為全 價(jià)顆粒飼料，置于塑料動(dòng)物盒內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn) 食、飲水。大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng) 5 d 后單只飼養(yǎng)于不 銹鋼籠內(nèi)，染毒前禁食 18 h，均采用灌胃方式染 毒，染毒量為每千克體重 10 mL。

色譜條件：Phenomenex 反向 C1 8 色譜柱 (50 mm × 4.6 mm，5 μm)；流速 0.6 mL/min；柱溫 為室溫；進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù) 72% 的乙腈-水溶液 (含體積分?jǐn)?shù) 0.1% 甲酸)；等度洗脫。 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源 (ESI)；離子源溫度 450 ℃；噴霧電壓 5 000 V；碰撞氣壓力 20.704 kPa； 去簇電壓 28.00 V；入口電壓 5.20 V；碰撞入口電 壓 20.73 V；碰撞出口電壓 11.00 V；霧化氣 1 壓 力 344.827 kPa；霧化氣 2 壓力 384.615 kPa，氣簾 氣壓力 172.413 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 (MRM)； 氟噻草胺與內(nèi)標(biāo) (啶氧菌酯) 定量離子對(duì)分別為 364.10/194.20 和 368.10/145.20，碰撞能量分別為 14.00 和 26.00 eV。

通過預(yù)試驗(yàn)可知，400 mg/kg 劑量的氟噻草胺未導(dǎo)致 SD 大鼠死亡，給藥后 1 h 血漿中出現(xiàn)原藥，為吸收相，7 h 血漿中原藥濃度 達(dá)到高峰，為分布相，48 h 血漿中原藥濃度達(dá)到 最大濃度的 5%，為消除相。據(jù)此試驗(yàn)設(shè) 2 個(gè)處理 組：空白溶劑對(duì)照組和 400 mg/kg 染毒組。隨機(jī) 取雄性大鼠 16 只，包括空白溶劑對(duì)照組 1 只， 400 mg/kg 染毒組 15 只，給藥前禁食 18 h。經(jīng)口 灌胃法一次性給藥方式，給藥量為每千克體重 10 mL，給藥后將動(dòng)物放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，自由進(jìn)食、 飲水。分別于處理后 1、7 和 48 h 取染毒組大鼠 5 只， 48 h 取對(duì)照組大鼠，采用 V (CO2 )∶V (O2 ) = 80∶20 麻醉，腹主動(dòng)脈放血后解剖，取心、肝、 脾、肺、腎、腦、肌肉、睪丸、脂肪、胃、大腸 和小腸，分別用生理鹽水和蒸餾水沖洗后，裝入 惰性塑料袋中，于–20 ℃ 保存，待測(cè)。

將樣品解凍并剪碎、混勻，分 別稱取染毒組各組織 0.5 g，加入 1 mL 體積分?jǐn)?shù) 70% 的乙腈水溶液，勻漿，于 15 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min；取上清液 100 μL，依次加入 20 μL 內(nèi)標(biāo) (心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、腦、肌肉、睪丸和 脂肪添加 0.050 mg/L 的啶氧菌酯， 大腸、小腸和 胃添加 25.0 mg/L 的啶氧菌酯)，20 μL 乙腈，渦旋混 勻；再加入 200 μL 乙腈，渦旋混勻后于 15 000 r/min、 4 ℃ 下離心 10 min；取上清液適量，用體積分?jǐn)?shù) 70% 的乙腈水溶液稀釋 2 倍，待 LC-MS/MS 測(cè)定。

取空白組織，加入 2 倍體 積量的 70% 乙腈水溶液，勻漿，于 15 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min，取上清液作為空白對(duì)照組織 上清液。

分別考察了乙腈-水、甲醇-水以及乙腈-乙酸 銨作為流動(dòng)相對(duì)氟噻草胺響應(yīng)值的影響。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)：以乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，氟噻草胺的響應(yīng)值 較高，在水相中添加體積分?jǐn)?shù) 0.1% 的甲酸后，增 加了在 ESI+ 模式下的離子化效率。同時(shí)還考察了 有機(jī)相和水相不同配比對(duì)待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的 影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以體積分?jǐn)?shù) 72% 乙腈水溶液 (含 0.1% 甲酸) 作為流動(dòng)相時(shí)，氟噻草胺與內(nèi)標(biāo)的 響應(yīng)值較高，出峰時(shí)間合適，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品 測(cè)定無影響。在 m/z 50~500 范圍內(nèi)對(duì)氟噻草胺及內(nèi)標(biāo)啶氧 菌酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，獲得其總離子流圖 (TIC)。根據(jù)所得 TIC，確定各化合物的母離子 m/z 值，分別以母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，確定定性 和定量離子對(duì)；通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描優(yōu)化碰 撞能量、去簇電壓及碰撞出口電壓等參數(shù)。氟噻 草胺與啶氧菌酯的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖。心臟、肝臟、脾臟、肺、 腎臟、腦、肌肉、睪丸和脂肪在 0.005、0.02 和 0.08 mg/L 3 個(gè)添加水平下，小腸、大腸和胃在 0.25、1.0 和 8.0 mg/L 3 個(gè)添加水平下，氟噻草胺 在大鼠各組織勻漿液中的回收率在 87%~118% 之 間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 1.3%~11% 之間，滿足生物 樣品測(cè)定要求。氟噻草胺在 0.005~0.08 mg/L添加水平下，大鼠肝組織中的提取回收率在 96%~ 106% 之間，滿足生物樣品測(cè)定要求，基質(zhì)不影 響待測(cè)物的測(cè)定。

組織分布研究是農(nóng)藥毒物代謝動(dòng)力學(xué)研究中的重要組成部分，通過了解農(nóng)藥的組織分布特點(diǎn) 有助于確定毒物發(fā)揮毒性的靶點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)于揭示 農(nóng)藥的毒性作用機(jī)制、毒物的安全性評(píng)價(jià)以及中 毒解救都具有重要意義。目前，關(guān)于氟噻草胺的 代謝研究較少，未見其在大鼠體內(nèi)組織分布的相 關(guān)報(bào)道。