油橄欖葉抑菌分析（昆山舒美KQ-500DB使用）

1 材料與方法 

1． 1 實(shí)驗(yàn)材料

油橄欖葉提取物( OLE) : 由隴南田園油橄欖科 技開發(fā)有限公司提供，主要活性成分及含量為橄欖 苦苷 34． 62% 、總多酚 0． 15% 、總黃酮 10． 23% 。 大腸桿菌( Escherichia coli ) CVCC1570、抗四環(huán) 素大 腸 桿 菌、金黃色葡萄球菌 ( S． aureus) CVCC 1882、金黃色葡萄球菌( SH7) ，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān) 察 所; 表 皮 葡 萄 球 菌 ( Staphylococcus epidermidis) CMCC26069、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa) ATCC27853、蠟 狀 芽 孢 桿 菌 ( Bacillus cereus) CMCC( B) 63302，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究 院; 枯草芽孢桿菌( B． subtilis) ，保藏于西北師范大 學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、BR 生化試劑，購自海 博生物技術(shù)有限公司。氯化鈉、鹽酸小檗堿、氯化三 苯四氮唑( TTC) 、二甲基亞砜( DMSO) ，分析純。

LDZX － 30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申 安醫(yī)療器械廠; BT － 25S 型電子天平，德國賽多利 斯; IS － RDV1 型恒溫振蕩器，美國 Crystal; HFsafe 1500 型生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司; WP － RO － 10B 型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)，四川沃特 爾科技發(fā)展有限公司; TU － 1810DPC 型紫外可見分 光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司; DNP －9052 － 1A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有 限公司; 不銹鋼數(shù)顯卡尺，天 津 市 量 具 廠; KQ － 500DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1． 2 實(shí)驗(yàn)方法

10 倍稀釋法制備菌懸液: 分別吸取稀釋至 10 － 5 、 10 － 6 、10 － 7 、10 － 8 、10 － 9 倍的菌懸液 100 μL 于牛肉膏蛋 白胨瓊脂培養(yǎng)基中涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng) 18 h，對菌落 數(shù)在 30 ～300 之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，求平均值。最 終挑選菌液濃度為 106 ～107 CFU/mL 菌懸液備用。采用 96 孔板肉湯稀釋法測定 OLE 對 8 種供 試菌的 MIC 和 MBC。鹽酸小檗堿作為對照，每孔中 加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 100 μL，96 孔板的 A ～ D 行第 1 孔中加入 100 μL 64 mg /mL 的 OLE 樣 品，E ～ H 行第 1 孔中加入 100 μL 64 mg /mL 的鹽酸 小檗堿樣品，二倍稀釋法使藥液濃度呈梯度遞減，第 10 孔中取出的藥液與培養(yǎng)基混合液棄去，第 11 孔 為加藥不加菌液的陰性對照，第 12 孔為加菌液不加 藥的空白對照。除第 11 列和第 12 列，每孔中加入 5 μL 菌懸液，置于微型振蕩器上振蕩 1 min，使各孔 內(nèi)溶液混勻，37 ℃ 孵育 18 h，以肉眼觀察無渾濁的 藥液質(zhì)量濃度即為受試菌的 MIC。

2 結(jié)果與分析

8 種細(xì)菌對空白對照均表現(xiàn)出不 敏感或敏感度不明顯，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)銅綠假 單胞菌對 OLE 表現(xiàn)不敏感或低度敏感，OLE 對其他 7 種細(xì)菌都有抑菌作用。OLE 質(zhì)量濃度為 1 mg /mL 時(shí)，蠟狀芽孢桿菌和銅綠假單胞菌表現(xiàn)為不敏感，其 他細(xì)菌均表現(xiàn)為低度敏感。OLE 質(zhì)量濃度為 5 mg /mL 時(shí)，枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌分別表現(xiàn)為低度萄球菌、金黃色葡萄球菌( SH7) 及大腸桿菌的抑制 作用較強(qiáng)，對蠟狀芽孢桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑 制作用較弱。

與對照鹽酸小檗堿相比，OLE 對 枯草 芽 孢 桿 菌、表 皮 葡 萄 球 菌、金黃色葡萄球菌 ( SH7) 的抑菌效果低于鹽酸小檗堿，而對蠟狀芽孢 桿菌、金黃色葡萄球菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑菌效 果優(yōu)于鹽酸小檗堿，對大腸桿菌的抑菌效果與鹽酸 小檗堿的相當(dāng)。有研究報(bào)道橄欖苦苷對金黃色 葡萄球菌的 MIC 為 0. 031 2 ～ 0． 125 mg /mL; 橄欖總 黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌均有抑 制作用，對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的 MIC 分別為 0． 25、0． 125、0． 062 5 mg /mL。以上研 究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能主要與供試樣品 的來源及純度有關(guān)系。

3 結(jié) 論

采用稀釋法分析了 OLE 對 8 種致病菌的 MIC 和 MBC。結(jié)果顯示，OLE 與鹽酸小檗堿在測試 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對銅綠假單胞菌無抑制作用，對表 皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑制作 用較強(qiáng)，對蠟狀芽孢桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑制 作用較弱。

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