青錢(qián)柳葉蛋白含量測(cè)定(KQ-500DE使用)

青錢(qián)柳又名一串錢(qián)、甜茶樹(shù)或搖錢(qián)樹(shù)，為胡桃科 植物青錢(qián)柳 Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk. 的落 葉喬木，是我國(guó)特有的珍稀瀕危物種，具有“植物 界大熊貓”“醫(yī)學(xué)界的第三棵樹(shù)”稱號(hào)。其葉具有甜 味，民間常以其為原料制備茶飲，具有生津止渴、 清熱解暑、降血糖、降血壓、調(diào)血脂等功效。青 錢(qián)柳葉含有黃酮、三萜及皂苷、多糖、無(wú)機(jī)元素和 氨基酸等化學(xué)成分，其所含黃酮、皂苷及多糖為主 要活性成分。本課題組前期譜效研究結(jié)果顯示， 除了青錢(qián)柳葉所含總黃酮、總皂苷及多糖與其降血 糖作用具有相關(guān)性外，可能其他部位含有蛋白、氨 基酸等成分的也有一定的降血糖作用。植物蛋白具 有熱量低、脂肪低及無(wú)膽固醇三大優(yōu)點(diǎn)，可大大降 低高血壓、高血脂、高膽固醇疾病發(fā)生的危險(xiǎn)，具 有動(dòng)物蛋白不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

1 材料

1.1 儀器

Mulitiskan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó) Thermo Fisher；UV-1800 紫外分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理 （中國(guó)）有限公司；十萬(wàn)分之一電子天平，賽多利斯 科學(xué)儀器（北京）有限公司；昆山舒美KQ-500DE 型超聲波清 洗儀，昆山市超聲儀有限公司；Centrifuge 5810R 型 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó) eppendorf 艾本德。

1.2 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），阿 拉丁試劑上海有限公司；2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯 并噻唑- 6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、三吡啶基三嗪 （TPTZ），上海源葉生物科技有限公司；維生素 C （VitC），西隴化工股份有限公司；考馬斯 G-250 （批號(hào)：EZ2811F373）、牛血清白蛋白（BSA）（批號(hào)： EZ28111E172）、α-葡萄糖苷酶、谷胱甘肽還原酶， 美國(guó) Sigma 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br />
1.3 藥材

不同產(chǎn)地青錢(qián)柳葉共 25 批，由湖北中醫(yī) 藥大學(xué)中藥資源與中藥化學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室葉曉 川 研 究 員 鑒 定 為 胡 桃 科 植 物 青 錢(qián) 柳 Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk. 的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 青錢(qián)柳葉蛋白含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品蛋白溶液的制備

取 BSA 3 mg，精密稱定，置于 10 mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即 得濃度為 0.305 mg·mL-1 的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取青錢(qián)柳葉粉（過(guò) 40 目 篩）1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入水 40 mL，超聲提取 45 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按方法配制考馬斯亮 藍(lán) G- 250 溶 液 。 分 別 取 0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、1.0 mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10 mL EP 管 中，加水定容至 1 mL，搖勻；再分別從中取 0.5 mL 溶液加入考馬斯亮藍(lán) G-250 溶液 5 mL，振蕩，放 置 2 min。同法制備空白溶液，于 595 nm 下測(cè)定吸 光度（A）。以蛋白質(zhì)濃度（C）為 X 軸，吸光度（A）為 Y 軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為 A=2.238 C+0.068 9（r=0.995 5）。 結(jié)果表明對(duì)照品 BSA 在 0.030 5～0.305 0 mg·mL-1 范 圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 不同產(chǎn)地青錢(qián)柳葉蛋白的含量測(cè)定

取不同產(chǎn) 地共 25 批青錢(qián)柳葉，按 2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品 溶液，從中取 0.5 mL 溶液，其余按 2.1.3 項(xiàng)下條件操 作。以干燥品計(jì)算各樣品中蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.2 青錢(qián)柳葉蛋白體外降血糖活性研究

2.2.1 青錢(qián)柳葉蛋白提取純化

從表 1 可看出，產(chǎn) 地為江西省修水縣黃坳山（6 月）的青錢(qián)柳葉，蛋白含 量（1.00%）適中，具有代表性，故選取黃坳山（6 月） 的青錢(qián)柳葉提取蛋白質(zhì)進(jìn)行體外降血糖及抗氧化活 性實(shí)驗(yàn)。稱取黃坳山（6 月）青錢(qián)柳葉粉末 100 g，按 2.1.2 項(xiàng)下條件提取青錢(qián)柳葉蛋白質(zhì)，得到蛋白質(zhì)粗 提取液。往粗提液中加入硫酸銨至 80%飽和度，待 蛋白質(zhì)完全沉淀，離心（12 000 r · min-1 ）15 min，取 沉淀，得較純的蛋白質(zhì)。用純水溶解成蛋白質(zhì)母 液。按 2.1.3 項(xiàng)下操作計(jì)算得該蛋白質(zhì)母液的濃度。

2.2.2 對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制作用

按方法配 制谷胱甘肽（GSH）溶液和 α-葡萄糖苷酶溶液。將獲 得的青錢(qián)柳葉蛋白母液梯度稀釋，得到濃度為 0.001 9、0.007 4、0.013 0、0.018 5、0.024 1、0.029 6 g·L-1 的供試品溶液，分別精密吸取 0.2 mL 置于 10 mL EP 管中，向各個(gè) EP 管中依次加入 5 mL pH 為 6.8 的磷 酸二氫鉀緩沖溶液、0.2 mL GSH 溶液和 0.4 mL α-葡 萄糖苷酶，搖勻，放置在 37 ℃水浴中 5 min，再向 各管加入 0.5 mL 的 4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷溶 液，搖勻，然后在 37 ℃水浴中放置 30 min。取各管 反應(yīng)后的反應(yīng)液各 2 mL，加入 4 mL 的 NaCO3 溶液 中終止反應(yīng)。將終止反應(yīng)后的溶液用紫外-可見(jiàn)分光 光度計(jì)在 400 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。用未加 α-葡 萄糖苷酶的空白溶液調(diào)零。重復(fù)操作 3 次，取平均 值。計(jì)算該蛋白對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制率。抑制率 （%）=（1-Ai/As ）×100%。As 為純水對(duì) α-葡萄糖苷酶作 用的吸光度，Ai 為供試品對(duì) α-葡萄糖苷酶作用的吸 光度。以抑制率對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 為 Y=23.819X+0.123 8，r =0.998 9。計(jì)算青錢(qián)柳葉蛋 白的 IC50為 0.015 8 g · L-1 ，青錢(qián)柳葉蛋白對(duì) α-葡萄 糖苷酶的抑制作用隨濃度增加而增大，在 0.001 9～ 0.029 6 g · L-1 范圍內(nèi)量效關(guān)系明顯，見(jiàn)圖 1。

2.3 青錢(qián)柳葉蛋白體外抗氧化活性研究

用純水對(duì)青錢(qián)柳 葉提取的蛋白質(zhì)母液進(jìn)行梯度稀釋，得到濃度為 0.045 9、 0.091 8、0.137 8、0.183 7、0.229 6 g · L-1 的供試品 溶液。取 DPPH 適量，按配制 DPPH 醇溶液。 取 10 μL 上述供試品試液和 200 μL 的 DPPH 溶液， 先后加入 96 孔板中，于暗處反應(yīng) 30 min 后用酶標(biāo)儀 在 517 nm 處測(cè)定吸收波長(zhǎng)，VitC 為陽(yáng)性對(duì)照。重復(fù)操作 3 次，取平均值。計(jì)算該蛋白對(duì) DPPH 自由基 的清除率，清除率（%）=（1-Ai /As ）×100%。As為純水對(duì) DPPH 作用的吸光度，Ai為供試品對(duì) DPPH 作用的吸 光度。以抑制率對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得青錢(qián) 柳葉蛋白和 VitC 的 IC50 值。


3 討論

青錢(qián)柳乃珍稀樹(shù)種，僅存于中國(guó)，野生多以零星 分布，資源很少，目前主要依靠人工種植。本研究 采集了青錢(qián)柳主要產(chǎn)區(qū)的 25 批樣品，青錢(qián)柳葉蛋白 含量范圍為 0.58%～1.39%。研究結(jié)果顯示，產(chǎn)于貴 州的青錢(qián)柳葉蛋白含量普遍較低，產(chǎn)于江西修水地 區(qū)的則相對(duì)均較高，而同一產(chǎn)地不同采收期藥材蛋 白的含量差異較小，推測(cè)自然地理位置是影響青錢(qián) 柳葉蛋白含量的主要因素。



 

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