技術(shù)鑒定連翹中45種化學(xué)成分(KQ-300DB使用 )

連翹為木犀科連翹屬植物連翹[Forsythia suspensa （Thunb.）Vahl]的干燥果實(shí)，氣微香，味苦，性微寒，歸肺、 心、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效， 有“瘡家圣藥”之稱。連翹在臨床上常用于治療癰疽、瘰 疬、乳癰、丹毒、風(fēng)熱感冒、溫病初起、溫?zé)崛霠I、高熱煩 渴等癥 。現(xiàn)代藥理研究顯示，連翹具有抗炎、抗病毒、 解熱鎮(zhèn)痛、止嘔、保肝等作用，具有重要的開發(fā)價(jià)值 。 然而，目前研究者對(duì)連翹化學(xué)成分的研究多集中于單個(gè) 成分的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定 ，檢測(cè)手段單一，在線分 離與系統(tǒng)分析的報(bào)道較少，且所建立方法不能全面反映 連翹藥材的組成，這限制了對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的全面認(rèn) 識(shí)及多成分的快速定性定量分析，不利于該藥材資源的 深入開發(fā)與利用。隨著對(duì)連翹藥理作用研究的深入，其 化學(xué)成分的全面快速鑒定成為亟待解決的問題。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC 型 UPLC 儀（美國 Waters 公司）；AB Sciex Triple-TOFTM 5600 型 MS 儀（美國 Sciex 公司）； 昆山舒美KQ-300DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公 司）；BSA224S-CW型電子天平、BP211D型電子天平（德 國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸對(duì)照品（成都瑞芬思生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 號(hào) 分 別 為 L-012-171216、L010- 170301、L-007-160504，純度均≥98％）；蘆丁對(duì)照品（國 家食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707，純度：≥ 98％）；甲醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；乙腈（色 譜純，德國 Merck 公司）；甲酸（色譜純，美國 Fisher 公 司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 藥材

連翹藥材（青翹，采收時(shí)間為 2018 年 6 月，批號(hào)： 180601）購于北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，經(jīng) 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院霍金海副研究員鑒定為木犀科 連翹屬植物連翹[F. suspensa（Thunb.）Vahl]的果實(shí)。藥 材粉碎后過三號(hào)篩，備用。

2 方法

2.1 LC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1％甲酸水溶液（A）-0.1％甲酸 乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，5％B→25％B；3～ 13 min，25％B→80％B；13～23 min，80％B→100％B； 23～23.1 min，100％B→5％B；23.1～25 min，5％B）；流 速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 MS條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子化模式：電噴霧 正、負(fù)離子模式；離子噴霧電壓（ESI + /ESI －）：5 500 V/－4 500 V；離子源溫度：550 ℃，去簇電壓：80 V/－80 V；碰撞能量：35 eV/－35 eV，碰撞活化掃描能量：15 eV； 霧化氣體：N2；霧化氣、輔助氣壓力：379.2 kPa；氣簾氣壓 力：241.3 kPa；質(zhì)量掃描范圍：80～1 500 Da。對(duì)響應(yīng)值 超過100 cps的8個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子質(zhì) 量 掃 描 范 圍 為 50～1 500 Da，開 啟 動(dòng) 態(tài) 背 景 扣 除 （DBS）。采用 Analyst TF 1.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用 PeakView 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.3 供試品溶液的制備

取連翹細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功 率：300 W，頻率：100 kHz）處理30 min；放冷后，再次稱 定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻；溶液以0.22 µm微 孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

取連翹酯苷 A、連翹苷、綠原酸、蘆丁對(duì)照品適量， 精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容， 分別制成質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.5 UPLC-MS分析

取“2.3”“2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液，按 “2.1”“2.2”項(xiàng)下 LC 與 MS 條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖， 用于后續(xù)成分篩查與結(jié)構(gòu)鑒定。

3 結(jié)果

經(jīng)與對(duì)照品圖譜及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照，并結(jié)合 UPLC-MS所測(cè)得化合物的高分辨相對(duì)分子量結(jié)果進(jìn)行 成分分析，共鑒定出連翹藥材中的45個(gè)化合物，包括7 個(gè)苯乙醇苷類成分、5個(gè)木脂素類成分、5個(gè)萜類成分、12 個(gè)黃酮類成分、7個(gè)有機(jī)酸類成分、2個(gè)酚類成分、2個(gè)醌 類成分、2個(gè)苷類成分和3個(gè)其他成分。本研究共鑒定出45種化合物，主要包括木脂素類、 黃酮類、萜類、有機(jī)酸類等。選擇每一類化合物的代表 性化合物，同時(shí)考慮到連翹酯苷 A 和連翹苷為 2015 版 《中國藥典》（一部）中連翹項(xiàng)下含量測(cè)定的主要特征性 成分，故對(duì)連翹酯苷A、連翹苷、松脂醇、金絲桃苷、漢黃 芩苷、阿魏酸和奎寧酸等7種化合物進(jìn)行裂解特征分析。連翹含有大量的黃酮類成分，主要包 括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮等結(jié)構(gòu)母核，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，連 翹中含有金絲桃苷。36號(hào)化合物在ESI－模式下的準(zhǔn) 分子離子為m/z 463[M－H]－，糖鏈均裂脫去1分子半乳 糖形成碎片離子m/z 300[M－H－C6H11O5] －；糖鏈異裂脫 去 1 分 子 半 乳 糖 形 成 碎 片 離 子 m/z 301[M － H － C6H10O5] －；基峰離子 m/z 300 失去 1 分子 CO 和 1 個(gè) H 形 成碎片離子m/z 271[M－H－C6H11O5－CO－H]－；碎片離 子m/z 301失去1分子CO和1分子H2O形成碎片離子m/z 255[M－H－C6H10O5－CO－H2O]－。

4 討論

采用的UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)能夠在較短 時(shí)間內(nèi)完成復(fù)雜成分的分析工作，為連翹的化學(xué)成分鑒 定提供了一種高效的分析方法。中藥材成分復(fù)雜， 且不同成分之間的含量相差懸殊，UPLC系統(tǒng)采用粒徑 小于 2 µm 的柱填料用于成分分離，與傳統(tǒng)高效液相色 譜（HPLC）系統(tǒng)普遍采用的5 µm柱填料相比，前者理論 板數(shù)更高，可獲得更好的分離效果。由于連翹中含有大 量的黃酮類化合物，因此本課題組在流動(dòng)相中加入 0.1％甲酸，以提高黃酮類化合物檢測(cè)的靈敏度。質(zhì)譜條 件選擇的離子噴霧（ESI + /ESI－ ）電壓為 5 500 V/－4 500 V，在這個(gè)電壓條件下，所有離子都能獲得較高的電離效 率。去簇電壓選擇80 V/－80 V，在這個(gè)電壓條件下，可以 有效消除溶劑的離子簇，也可防止母離子發(fā)生源內(nèi)裂解。



 

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