單味藥白芍的質(zhì)量表征研究（昆山舒美KQ2200E使用

東漢《金匱要略》記載，黃芪桂枝五物湯由黃 芪、桂枝、白芍、生姜、大棗五味中藥組成，是治療痹 癥的名方，具有益氣溫陽、溫經(jīng)散寒、通痹止痛的功效 。“經(jīng)典名方標準顆粒研究”屬“重大新藥創(chuàng)制” 國家科技重大專項課題，該課題擬定了20個經(jīng)典名 方為研究對象，黃芪桂枝五物湯為其中之一。白芍 作為方中臣藥是其重要組成部分。白芍為毛茛科 植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，有養(yǎng)血 調(diào)經(jīng)、斂陰止痛、平抑肝陽之功效，主治血虛萎黃、 月經(jīng)不調(diào)、自汗盜汗、脅痛腹痛等。

1 材料與方法

1. 1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀（配有LC-20AT二 元泵、SPD-M20A二極管陣列檢測器、SIL-20AC自動 進樣器），日本島津公司；ACQUITY UPLC Xevo G2 Q-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀，美國 Waters 公司；Sartorius-BS 124S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；分體 式全自動電腦保健陶瓷鍋，潮安市天野電器廠；N1001D-WA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本Eyela公司；LGJ-25C型 冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；昆山舒美KQ2200E 型超 聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1. 2 試劑與材料

乙腈、甲醇（均為色譜純），美國Fisher Scientific 公司；乙酸、磷酸（均為分析純），國藥集團化學(xué)試劑 有限公司；水為娃哈哈純凈水；芍藥苷（純度99.30%） 對照品，中國食品藥品檢定研究院；白芍各批次均由仲景宛西制藥股份有限公司提供，批號：140000、 140001，產(chǎn)地浙江；批號：140212、141101、141102、 141103、150823、150826、150901、150903產(chǎn)地為安徽。

1. 3 白芍水煎劑凍干粉的制備

稱取9.0 g白芍置于陶瓷鍋中，加水1200 ml，浸 泡30 min，稱取總質(zhì)量，設(shè)定時間120 min，閉蓋武火 煮沸后開蓋繼續(xù)煎煮，至減重750 g后停止煎煮，兩 層紗布趁熱過濾得濾液。將濾液減壓濃縮后冷凍 干燥，得白芍水煎劑凍干粉，保存于干燥器中備用。

1. 4 白芍水煎劑HPLC指紋圖譜的建立

1. 4. 1 供試品溶液的制備

精密稱取白芍水煎劑 凍干粉0.05 g，以50%甲醇溶解并定容于10 ml容量 瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1. 4. 2 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷 酸水溶液（B）；檢測波長：230 nm；柱溫：30℃；流速： 1.0 ml/min；進樣量：20 μl。梯度洗脫程序：0~15 min， 5% A~15% A；15~45 min，15% A~25% A；45~65 min， 25% A~50% A。

1. 5 共有峰定性鑒別

1. 5. 1 供試品溶液的制備

精密稱取白芍凍干粉 0.05 g，以 5%甲醇溶解并定容于 10 ml 容量瓶中， 0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1. 5. 2 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%乙 酸水溶液（B）；檢測波長：230 nm；柱溫：室溫；流速： 1.0 ml/min；進樣量：5 μl。梯度洗脫程序：0~15 min， 5% A~15% A；15~45 min，15% A~25% A；45~65 min， 25% A~50% A。

1. 5. 3 質(zhì)譜條件

正/負離子模式分別檢測；采集 范圍m/z 50~1500；ESI離子源參數(shù)：毛細管電壓：1.7 kV； 錐孔電壓：30.0 V；提取錐孔電壓：4.0 V；源溫： 100℃；脫溶劑氣溫度：250℃；錐孔氣流量：30.0 L/h； 脫溶劑氣流量：350.0 L/h；陷阱碰撞能量：6.0 V；傳 遞碰撞能量：4.0 V。

1. 6 芍藥苷含量測定

1. 6. 1 對照品溶液的制備

精密稱定芍藥苷標準 對照品粉末10.04 mg，加甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，即得濃度為1004 μg/ml的對照品溶液。

1. 6. 2 樣品溶液的制備

精密稱取白芍水煎劑凍 干粉0.05 g，置具塞試管中，加5 ml甲醇，稱質(zhì)量，超聲 （40 kHz，300 W）提取30 min，放冷補重，搖勻過濾， 續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得樣品溶液。

1. 6. 3 陰性樣品溶液的制備

精密量取5 ml甲醇 置具塞試管中，按1. 6. 2項樣品溶液的制備方法操 作，即得陰性樣品溶液。

1. 6. 4 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；流動 相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（13∶87）；柱溫：30℃；流 速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；洗脫方式：等度洗脫 30 min。

2 結(jié)果

2. 1 白芍水煎劑指紋圖譜色譜條件的優(yōu)化

2. 1. 1 檢測波長的選擇

采用島津 SPD-M20A 二 極管陣列檢測器，對供試品溶液進行掃描，掃描波 長范圍 190～400 nm，考察檢測波長在 230、254 及 270 nm下的色譜峰分離情況，對比不同波長下HPLC 圖譜，在230 nm波長下，白芍HPLC指紋圖譜的色譜 峰豐度高且分離度好。故檢測波長選用230 nm。

2. 1. 2 流動相的選擇

流動相對色譜峰的分離有 著重要影響。首先對有機系流動相甲醇、乙腈進行 考察，在確定了以乙腈為有機相的基礎(chǔ)上，繼而考 察在水系流動相中加不同體積分數(shù)的乙酸或磷酸 對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)在流動相中加乙酸后基線噪 聲較大且漂移較嚴重，而加磷酸可明顯消除噪聲且 能優(yōu)化峰形，并改善色譜峰的分離效果，綜合考慮 后確定流動相體系為：乙腈-0.05%磷酸水溶液。

2. 1. 3 柱溫的選擇

色譜柱溫度的變化對色譜峰 的分離效果有較強的影響，考察柱溫在 25、30 及 35℃時色譜峰的分離情況，隨著柱溫升高，色譜峰保 留時間提前，分離度下降。綜合考慮選取柱溫為30℃。


2. 1. 4 流速的選擇

流速也是影響色譜峰分離的 關(guān)鍵，考察流速在 0.6、0.8、1.0 及 1.2 ml/min 時色譜 峰的分離情況，流速變快，色譜峰保留時間提前，分 離度下降。綜合考慮確定流速為1.0 ml/min。

2. 1. 5 復(fù)溶溶劑的選擇

選取不同的復(fù)溶溶劑進 行復(fù)溶會對樣品中各化學(xué)成分的溶解情況產(chǎn)生一 定影響，也會相應(yīng)影響指紋圖譜中色譜峰的響應(yīng)值 及豐度。考察100%、50%及5%甲醇分別復(fù)溶樣品 時的色譜圖情況，綜合考慮選擇使用50%甲醇對樣品進行復(fù)溶。

2. 2 白芍水煎劑指紋圖譜方法學(xué)確證

2. 2. 1 精密度

取同一供試品溶液，按1. 4. 2項色 譜條件連續(xù)進樣6次，考察精密度，確定內(nèi)標峰后， 測得各共有峰和內(nèi)標峰之間的相對保留時間和相 對峰面積的 RSD 均＜5.0%，表明本法精密度良好， 儀器性能穩(wěn)定。

2. 2. 2 穩(wěn)定性

將供試品溶液按1. 4. 2項色譜條 件，在0、2、4、8、12和24 h分別進樣，考察穩(wěn)定性，測 得各共有峰和內(nèi)標峰之間的相對保留時間和相對 峰面積的 RSD 均＜5.0%，穩(wěn)定性良好，可判斷供試 品溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2. 2. 3 重復(fù)性

按1. 4. 1項制備方法平行制備6份 供試品溶液，依1. 4. 2項色譜條件分別進樣，考察重 復(fù)性，測得各共有峰和內(nèi)標峰之間的相對保留時間 和相對峰面積的RSD均＜5.0 %，表明本法重復(fù)性良 好。

2. 3 白芍水煎劑HPLC指紋圖譜的建立

按1. 4項方法，建立白芍水煎劑HPLC指紋圖譜 ，主要色譜峰得到了較好的分離，共標記了12 個共有色譜峰。

2. 4 共有峰定性鑒別

依1. 5項方法，采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)， 得白芍水煎劑正、負離子模式下的總離子流色譜圖。依據(jù)紫外色譜圖和總離子流色譜圖色 譜峰保留時間之間的對應(yīng)關(guān)系，及各色譜峰相對應(yīng) 的質(zhì)譜參數(shù)（準分子離子峰質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)譜碎片 質(zhì)量數(shù)），初步定性鑒別出白芍水 煎劑 HPLC 指紋圖譜中所標記的 12 個共有峰里的 11個。

3 討論

在前期完成對經(jīng)典名方黃芪桂枝五物 湯質(zhì)量表征工作的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入對其組方單味 藥白芍進行相關(guān)研究。建立了白芍水煎劑化學(xué)成 分的HPLC指紋圖譜，且通過方法學(xué)確證，表明方法 可靠，可作為白芍質(zhì)量評價的HPLC 指紋圖譜研究 方法。利用 HPLC-Q- TOF-MS/MS 技術(shù)對白芍的 HPLC指紋圖譜中所標記的若干共有峰進行了定性 鑒別，初步明確了其中11個色譜峰的化學(xué)成分。并 對10個批次的白芍進行了相似度評價，得到了白芍 因產(chǎn)地、氣候、種植條件等不同造成批間相似度較 低，質(zhì)量差異較大的結(jié)論，為今后單味藥的選擇提 供了一定依據(jù)。此外，選取芍藥苷作為白芍的指標成分，進行了10個批次白芍凍干粉中指標成分的含 量測定，針對含量測定結(jié)果差異較大的問題，做出 以下推測：一是實驗所用各批次白芍飲片，均是經(jīng) 加工后得到，但根據(jù)相似度評價及共有峰定性鑒別 結(jié)果可知，各批白芍均含有芍藥苷亞硫酸酯，而該 成分是藥材在加工過程中采用硫磺熏蒸時由芍藥 苷轉(zhuǎn)化所得，那么可以推測，各批次使用硫磺加工 熏蒸的過程不統(tǒng)一，本就致使白芍飲片的芍藥苷含 量不盡相同，甚至差異較大；二是各批次白芍本身 的產(chǎn)地不同，溫濕度等氣候條件、采收時間以及具 體生長環(huán)境也都各不相同。



 

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