氨基酸含量測定的研究-昆山舒美KQ500DE使用

珍珠層粉為蚌科動物三角帆蚌 Hyriopsis cumingii （Lea）、褶紋冠蚌Cristaria plicata（Leach）或珍珠貝科動 物馬氏珍珠貝 Pteria martensii（Dunker）的貝殼珍珠層 加工而成的粉末 ，具有鎮靜安神、解毒生肌、美容養 顏、明目消翳、治療潰瘍、祛除肝火等功效，收載于 《衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第六冊）》、四川省中 藥材標準（1987年版）以及福建省中藥材標準（2006年 版）等標準中。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀（PDA 檢測器），昆山舒美KQ500DE 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），25 mL 氨基酸消解管，氨基酸分析柱 Venusi1- AA （4.6 mm × 250 mm，5 μm，艾杰爾科技），鼓風干燥箱 （天津市泰斯特儀器有限公司），1000 μL 移液槍 （eppendorf），200 μL移液槍（eppendorf），20 μL移液槍 （eppendorf），十萬分之一分析天平（Mettler Toledo 公 司），氮吹儀，DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰 斯特儀器有限公司），真空抽濾系統（IKA），抽濾瓶，燒 杯，玻璃棒，容量瓶，蒸發皿，0.22 μm微孔濾膜，一次性 2 mL注射器（江蘇宇陽醫療器械有限公司），離心管。

1.2 試藥

1.2.1 試劑

氨基酸分析方法包：17 種氨基酸混合標準品（天 門冬氨酸 Asp、谷氨酸 Glu、絲氨酸 Ser、甘氨酸 Gly、組 氨酸 His、精氨酸 Arg、蘇氨酸 Thr、丙氨酸 Ala、脯氨酸 Pro、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val、蛋氨酸Met、異亮氨酸Ile、 亮氨酸 Leu、苯丙氨酸 Phe、賴氨酸 Lyb 各為 2.5 μmol· mL- 1 ，胱氨酸 Cys 為 1.25 μmol·mL- 1 ）、正亮氨酸標準 品、三乙胺、異硫氰酸苯酯（PITC）等（均由艾杰爾科技 提供）；純凈水，色譜乙腈（賽默飛世爾科技），無水醋酸 鈉（北京化工廠）、乙酸（色譜級，賽默飛世爾科技）、濃 鹽酸（37.5%，北京化工廠）、正已烷（天津市津科精細 化工研究所）。

1.2.2 溶液配制

（1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺 1.4 mL，加乙腈 8.6 mL，混勻。
（2）異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯 25 μL，加乙腈2 mL混勻。
（3）流動相 A：80%乙腈；水溶液流動相 B：稱取 15.2 g無水乙酸鈉，加水1850 mL，溶解后用乙酸調pH 至6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過濾。
（4）正亮氨酸內標溶液：稱取正亮氨酸約 10 mg， 加0.1 mol·L-1 鹽酸溶液10 mL使溶解，混勻。

1.2.3 珍珠層粉藥材

共收集了 17 批珍珠層粉，來自于浙江、河南、廣 東、廣西、湖南、安徽等六個省份，17批珍珠層粉的樣 品信息，其中S5-6，S13-16號樣品通過公司途徑 收集，其余樣品均收集于當地珍珠養殖場，收集時均為 新鮮或干燥蚌體，依照文獻中記載的珍珠層粉制備方 法，經本實驗室后期加工得到。三角帆蚌基源的 珍珠層粉均為淡水珍珠層粉，而馬氏珍珠貝基源的珍 珠層粉均為海水珍珠層粉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

采 用 Venusi1- AA 氨 基 酸 分 析 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），以 80%乙腈水溶液為流動相 A，以乙 酸鈉-乙腈-水溶液作為流動相 B（pH 為 6.5），柱溫： 28℃，進樣量：10 μL，檢測波長：254 nm，流速：0.9 mL· min-1 ，樣品溫度：5℃，梯度洗脫程序。理論塔板 數按正亮氨酸峰計算應不低于2 × 105 ，所有組分均在 45 min內出峰，17種氨基酸混合標準品，珍珠層粉氨基 酸色譜圖。

2.2 粗蛋白的制備

由于珍珠層粉中含有較多的鈣鹽，如果直接進行 水解，將與鹽酸發生反應，生成大量的二氧化碳氣體， 致使水解無法進行，故需要先制取粗蛋白。 準確稱取珍珠粉約10.0 g于1000 mL燒杯中，加水 10 mL，攪拌調成糊狀，緩慢分次加入6 moL·L-1 的稀鹽 酸酸化4次，每次10 mL（酸化過程中產生的泡沫不得 有溢出等流失現象），在酸化的過程中，需要充分攪拌， 讓稀鹽酸和鈣鹽充分反應，自然放置，待泡基本消退 后，取合適大小的濾紙進行抽濾，并以水洗滌使其充分 轉移，抽濾近干時，續加6 moL·L-1 的鹽酸適量，浸沒固 體物，檢查有無氣泡產生，輕輕震搖 10 min 使反應充 分，再抽濾，并重復上述浸泡操作，直至無氣泡產生，最 后以水洗滌至洗液呈中性，得橙黃色或桔黃色粗蛋白 質。進行干燥和稱重，計算粗蛋白產率 。

2.3 供試品衍生溶液的制備

精密稱取含量測定項下粗蛋白質 10 mg，置于 25 mL耐高溫氨基酸消解管中，準確加入6 moL·L-1 的 鹽酸5 mL，加蓋密封，置于110℃下，水解24 h，取出，放 冷，開瓶，將水解液過濾并轉移至蒸發皿中，水浴蒸干， 殘渣以0.1 mol·L-1 稀HCl溶解，移入5 mL容量瓶中，定 容，搖勻，微孔濾膜精濾（0.22 μm），取續濾液 200 μL 至 2 mL 小瓶中，依次準確加入 14％的三乙胺乙腈溶 液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液各 100 μL，并準確加入正 亮氨酸內標溶液 20 μL 加蓋，混勻，置于室溫下衍生 90 min，加正已烷400 μL，振搖，靜置約10 min，取下層 溶液，用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，取續濾液200 μL， 加入800 μL水稀釋，搖勻，于高效液相小瓶中待用。

2.4 氨基酸混合標準品衍生溶液的制備

按 2.3 所述，取混合氨基酸標準溶液 200 μL 至 2 mL小瓶中，自“依次準確加入14％的三乙胺乙腈溶 液”起，至“高效液相小瓶中待用”即得空白溶液。

3 數據分析

利用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度 評價系統（2012.130723 版本）”軟件對 17 批不同基源 和產地的珍珠層粉藥材進行相似度評價。17批珍珠層粉藥材圖譜與對照指紋圖譜的相似度范圍為 0.881-0.996，說明珍珠層粉藥材的質量存在一定差 異。除了S1號樣品（浙江諸暨2017年）和S11號樣品 （浙江諸暨 2018 年）圖譜與對照圖譜的相似度小于 0.90以外，其他各批次藥材圖譜與對照圖譜的相似度均大于 0.90，相似度在 0.90 以上的藥材占 88.24%，可 見大部分藥材質量比較接近，說明藥材中氨基酸成分 相似度較高，但可能由于珍珠層粉藥材生產過程中受 到氣候、水質、環境等因素以及采收加工過程中諸多因 素的影響，表現出一定的差異。

4 結論

本次研究收集了來自6個省份、兩種基源（馬氏珍珠貝和三角帆蚌）的17批珍珠層粉，首次建立了珍珠 層粉的氨基酸指紋圖譜，并較為全面地分析和測定了 珍珠層粉中氨基酸的含量。

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