延胡索總生物堿的急性毒性分析-KQ-500DE使用

延胡索又名元胡、延胡、元胡索，是罌粟科植物延 胡索（Corydalis Rhizoma）的干燥塊莖，為歷代中醫 藥學家推崇的鎮痛藥，具有活血化瘀、理氣止痛等功 效。《本草綱目》記載延胡索“專治一身上下諸痛”， 《本草正義》云其“……主一切肝胃胸腹諸痛……”。

1 儀器和材料

1.1 主要儀器

JA2003N 電子天平購于上海精密 儀器有限公司；XS105 分析天平購于梅特勒-托利多 儀器有限公司；昆山舒美KQ-500DE 型數控超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司；RE-3000 旋轉蒸發 儀為上海亞榮生化儀器有限公司產品；DGG-9053A 電熱恒溫鼓風干燥箱購于上海森信實驗儀器有限公 司；Millipore Synergy 超純水系統為美國密理博公司 產品。

1.2 藥品和試劑

延胡索總生物堿為本課題組自制 （質量分數 68.19%）；延胡索乙素對照品購于中國食 品藥品檢定研究院（質量分數 99.80%，批號：110726- 201414）；冰醋酸購于天津市永大化學試劑有限公司 （批號：20131006）；0.9%氯化鈉注射液購于山東齊都 藥業有限公司（批號：2A15102402）；阿司匹林維生素 C 泡騰片購 于拜耳 醫藥 保 健有限 公 司 （批 號： BTAEEA1/2）；鹽酸嗎啡注射液購于東北制藥集團沈 陽第一制藥有限公司（批號：150911-1）。

1.3 實驗動物

SPF 級 ICR 小鼠 200 只，雌雄各半， 4～6 周齡，體質量（20±2）g，由上海西普爾-必凱實驗 動物有限公司提供 [實驗動物生產許可證號：SCXK （滬）2013-0016]；SPF 級 KM 小鼠 100 只，雌性，4～6 周齡，體質量（20±2）g，由上海斯萊克實驗動物有限責 任公司提供 [實驗動物生產許可證號：SCXK （滬） 2012-0002]。所有小鼠均飼養于浙江中醫藥大學動物 實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013- 0184]，相對濕度 40%～50%，室溫 20～25℃。普通飼料 喂養，自由攝食，充分給水。

1.4 方法

1.4.1 對照藥物配制

阿司匹林維生素 C 泡騰片以 超純水溶解并定容，配制成終濃度為 10mg·mL-1 的阿 司匹林溶液 20mL 備用。10mg·mL-1 鹽酸嗎啡注射液，以 0.9%氯化鈉注射液稀釋，配制成 1mg·mL-1 的鹽酸 嗎啡注射液 20mL 備用。延胡索乙素對照品以超純水 配制成濃度為 1.5mg·mL-1 的混懸液 20mL 備用。

1.4.2 鎮痛試驗藥物劑量設置

取延胡索總生物堿 原料藥，以超純水分別配制成 5 個不同濃度的延胡索 總生物堿混懸液各 20mL，含總生物堿含量分別為 12、6、3、1.5、0.75mg·mL-1，分別為更高劑量組、高劑量 組、中劑量組、低劑量組、更低劑量組。

1.4.3 延胡索總生物堿小鼠急性毒性試驗

1.4.3.1 預試驗

選取 ICR 小鼠 50 只，雌雄各半，分 為 5 組，每組 10 只，禁食不禁水 12h 后以不同劑量的 延胡索總生物堿混懸液灌胃，觀察各組小鼠死亡情 況，測定動物最小全致死量 (minimum lethal dose， Dm) 和最大全不致死量 (maximum non lethal dose， Dn)，確定劑量范圍。

1.4.3.2 急性毒性試驗

選取 ICR 小鼠 70 只，雌雄 各半，分 7 組，每組 10 只，灌胃前禁食不禁水 12h。根 據預試驗確定的 Dn～Dm 范圍，按比例配制成 6 組劑 量梯度的延胡索總生物堿藥液各 20mL 備用。第 1～6 組小鼠分別以不同劑量的 6 組藥液灌胃給藥 1 次，給 藥量為 0.4mL·10g-1；第 7 組為正常組，灌胃等體積超 純水。給藥后每日觀察，連續 2 周，期間正常飲食。記 錄所有小鼠出現的癥狀及死亡情況，對試驗期內死亡 的小鼠和試驗結束后處死的正常組小鼠進行尸體解 剖，觀察各臟器的病理變化。以 Bliss 法計算小鼠 LD50 及 95%置信區間。

1.4.4 延胡索總生物堿鎮痛作用研究

1.4.4.1 小鼠醋酸扭體試驗

選取 ICR 小鼠 80 只， 雌雄各半，經適應性飼養 1 周后，隨機分成 8 組，每組 10 只，分別為：空白對照組（超純水組）、陽性對照組 （阿司匹林組）、延胡索乙素組、更高劑量組、高劑量 組、中劑量組、低劑量組、更低劑量組，各藥物劑量分 別參考 1.4.1 和 1.4.2。各組小鼠均灌胃給藥，給藥量 為 0.4mL·20g-1。各組小鼠給藥后 1h，經腹腔注射 0.6%冰醋酸 0.2mL·20g-1，然后記錄 15min 內小鼠的 扭體次數，計算扭體次數抑制率。 扭體次數抑制率（%）=（空白對照組扭體次數-各 給藥組扭體次數）/空白對照組扭體次數×100%

1.4.4.2 小鼠熱板致痛試驗

選取 KM 小鼠 100 只， 適應性飼養 1 周后，放入（55±0.5）℃的熱板中，從 中篩選出合格的雌性小鼠 80 只 （凡舔后足時間小于 5s 或大于 30s 的棄之不用）。將合格小鼠隨機分 成 8 組，空白對照組（超純水組）、陽性對照組（鹽 酸嗎啡注射液組）、延胡索乙素組、更高劑量組、高 劑量組、中劑量組、低劑量組、更低劑量組，每組 10 只，各藥物劑量分別參考 1.4.1 和 1.4.2。鹽酸嗎啡 注射液經腹腔注射，0.2mL·20g -1，其他各組均灌胃 給藥，0.4mL·20g-1。各組于給藥前重復測量痛閾 3 次，取平均值作為該小鼠給藥前痛閾值。給藥 后 30、90、180min 各測定 1 次痛閾值。 1.5 統計學分析 應用 SPSS 20.0 統計軟件進行統 計學分析，計量資料以 x±s 表示，多組間比較采用單 因素方差分析，組間兩兩比較采用 t 檢驗。以 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

按照設定的劑量一次灌胃給藥后，部分小鼠出現 精神狀態不佳、眼眶變黑等現象，大約半小時出現抽 搐、尿失禁、死亡；隨著劑量增高，此反應加強；未達到 致死劑量的小鼠給藥后出現短暫的精神倦怠現象，隨 后活動正常。對處死的正常組小鼠及急性毒性試驗 死亡小鼠進行解剖可知，小鼠臟器外形、體積、色澤均 正常，無充血、腫脹和壞死等異常病理表現。與空白對照組比較， 各給藥組對冰醋酸所致的小鼠扭體均具有顯著的抑 制作用，差異均具有統計學意義（P＜0.01）；與阿司匹 林組比較，除延胡索乙素組和延胡索總生物堿更低劑 量組扭體次數增多外（P＜0.01），其他各組扭體次數差 異無統計學意義（P＞0.05）；與延胡索乙素組比較，除 延胡索總生物堿更低劑量組外，其他各組扭體次數均 減少（P＜0.01，P＜0.05）。與延胡索乙素組比較，僅延胡索總生物堿更低劑 量組 3 個時間段痛閾值短于延胡索乙素組（P＜0.05）； 而延胡索總生物堿更高劑量組、高劑量組 3 個時間段 痛閾值均長于延胡索乙素組；中劑量組、低劑量組給 藥 30min 后痛閾值也長于延胡索乙素組，給藥 90min 與 180min 后痛閾值則短于延胡索乙素組，但均無統 計學差異（P＞0.05）。

3 討論

LD50 是預期引起 50%動物死亡的劑量，是評價藥 物，包括從中藥、天然藥物中提取的有效部位安全性 的重要指標之一，對后期實驗的劑量設置和制劑的制 備具有重要參考價值。小鼠急性毒性試驗結果表明， 延胡索總生物堿的 LD50 為 473.36mg·kg-1，提示延胡索 總生物堿具有一定的毒性，為后續制劑研制劑量設置 提供了實驗依據，其長期毒性還需進一步考察研究。