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不同砷 （As） 形態的毒性差異很大。 一般 認 為， 無機砷（iAs）的毒性高于有機胂， 三價砷的毒 性大于五價砷。 甲基化的形態胂也具有一定的遺傳 毒性和致癌性。 除飲用水外， 大米是人體砷攝入 的重要來源。 不同品種的稻米及其制品中有機胂 和 iAs 的含量差異很大。 已證實稻米 As 形態不 同， 其生物有效性、 毒性也不同。 因此， 用總 As 評估砷毒性雖簡單易行， 但并不科學。 只有對稻 米中各種形態 As 進行全面分析， 才能對稻米 As 的 安全性作出科學、 客觀評價。 為此， 有必要建立稻 米中 As 形態的檢測方法。
1260 infinity 高效液相色譜 儀 （美國 Agilent 公司）、 7700 電感耦合等離子體 質譜儀 （ICP－MS， 美國 Agilent 公司）， EASY 超 純水機 （DUBUQUE， IOWA， U.S.A）、 PM400 電 子天平 （瑞士 METTLER 公司）、 PHS－3C 精密 pH 計 （上海雷磁儀器公司）、 MS3 basic 漩 渦 振 蕩 儀 （德國 IKA 公司）、 KQ－800TED型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、 5804R 臺式高速冷凍 離心機 （德國 eppendorf 公司） 等。
甲醇 （色譜純， Merck）， 磷酸氫二銨、 磷酸二氫銨、 碳酸銨、 硝酸銨、 磷酸 （GR 級， 廣州化學試劑廠）， 三氟乙酸 （TFA， 純 度≥95.0％， ACS）， 硝酸 （68％～70％， GR 級， 廣州化學試劑廠）， 實驗室用水為 Milli－Q 高純水。 砷 標 準 溶 液 ： As （ V） （GBW08667） 、 As （ III） （GBW08666） 、 MMA （ GBW08668） 、 DMA （GBW08669） 以及 As 單標準儲備液 （1 000 mg/L） 均購于國家標準物質中心， ASA （99.99％） 購買 于阿拉丁試劑有限公司。 5 種 As 形態混合標準儲 備液： 用純水將 As （III）、 As （V）、 MMA、 DMA 4 種 As 形態稀釋成質量濃度均為 400 mg/L （以 As 計） 的標準儲備液， 用甲醇將 ASA 溶解成質量濃 度 為 400 mg/L （以 As 計） 的 標 準 儲 備 液， 置 于 4℃冰箱中避光保存。 砷標準工作液和混合標準工 作液現用現配。 實驗用的稻米和水稻植株樣品來源于添加 ASA 的盆栽實驗。
首先對 ICP－MS 的儀器條件 進行確定， 再篩選和優化色譜條件， 確定 HPLC－ ICP－MS 的條件。 根據此條件， 進行方法學考察， 主要包括檢出限、 定量限、 線性范圍、 精密度的確 定。 結合加標回收方式考察方法準確度。 保留時間 定性， 峰面積定量。 采 用 1 μg/L 的 7 Li、 59Co、 89Y、 115In、 140Ce、 205Tl、 238U 調諧液對儀器參數進行優化。 該條件確 保 ICP－MS 儀器的工作正常運行， 并且保證質譜 條件一樣的情況下考察 HPLC 條件的可行性。 通過 微調載氣流量、 稀釋氣流量、 碰撞器流量、 RF 電 壓、 透鏡偏轉電壓等參數， 使儀器的靈敏度最高， 同時氧化物和雙電荷的產率最低， 雙電荷、 分辨率等指標符合 ICP－MS 儀器最佳測定條件。 優化后 的 ICP－MS 工作參數見表 1。
取待 測稻米樣品于旋風研磨儀中粉碎， 過 100 目篩， 準 確 稱 取 樣 品 0.3000 g， 置 于 50 mL 聚 丙 烯 離 心 管 中， 加入 6 mL 50％甲醇水溶液， 渦旋混勻， 再置 于超聲波清洗器中室溫提取 30 min 后， 在 10 000 r/min 下 離 心 30 min， 上 清 液 過 0.22 μm 濾 膜 后， 放在 4℃冰箱里， 供 HPLC－ICP－MS 分析。 水稻植株樣品的前處理： 水稻植株的樣品經打 漿機粉碎后， 稱取 0.300 0 g， 置于 50 mL 聚丙 烯 離心管中， 加入 6 mL 50％甲醇水溶液， 后續操作 同稻米樣品前處理方法。 空白實驗是直接向 50 mL 聚 丙 烯 離 心 管 中， 加入 6 mL 50％甲醇水溶液， 后續操作同稻米樣品 前處理方法。
按照 BATISTA 等 給出的方法， 采用單標和混標進樣方式進行確定。 結果表明， 使用 10 mM HPO4 2－/HPO4 － （98％ v/v） + 甲 醇 2％ （ v/v） （pH 8.5） 作 為 流 動 相 時， As （Ⅲ） 峰 分 叉， As （Ⅴ） 出 峰 時 間 長， ASA 未 出 峰。 使用甲醇－0.1％ （體積分數） 三氟乙酸水溶液 （體 積 比 1∶9） 作 為 流 動 相 時， ASA 在 40 min 內未出峰。 使用 20 mmol/L （NH4）2HPO4 （pH 6.0） 和 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH 值為 8.5） 作為流動相梯度洗脫時， ASA 與 As （Ⅲ） 、 As （Ⅴ） 、 DMA、 MMA 峰達到基線分離， 但 As （Ⅲ）、 As （Ⅴ）、 DMA、 MMA 的 4 個峰未基線分離， 峰交叉 與重疊嚴重。 選擇水和 50 mM （NH4）2HPO4 （pH 值為 6.0） 梯度洗脫作為流動相時， As （Ⅲ）、 As （Ⅴ ） 、 DMA、 MMA、 ASA 分 離 效 果 較 好 。 但ASA 的保留時間約為 23 min， 該法檢測一個樣品 耗時長 （需 25 min）， 且梯度設定較為麻煩。 若沒 有多元泵， 就難以進行梯度洗脫， 方法將受到限 制。 另外， 方法研究中發現， 使用梯度洗脫會導致洗 脫后期基線上升。 考慮到 ASA 溶于有機試劑， 試 探性地使用 50 mM （NH4）2HPO4 （pH＝6.0） 和 2％ 甲 醇 等 度 洗 脫 ， 結果該組合能夠 較好地將 As （Ⅲ） 、 DMA、 MMA、 As （Ⅴ） 、 ASA 分 離 開 來 （保留時間分別為 1.861、 2.032、 4.698、 7.505 和 13.664 min）， 且洗脫時間在 15 min 內。 為此， 選 擇 （NH4）2HPO4 +甲醇作為流動相的組成成分。
本研究建立了水稻中 5 種砷形態的高效液相色 譜－電感耦合等離子體質譜聯用測定方法。 結果表 明， 本方法適合于水稻各組織中 As（V）、As（III）、 DMA、 MMA 和 ASA 5 種砷形態的準確定性和定 量分析。 該方法便捷、 快速、 靈敏度和準確度高、 檢測重現性好、 耐用性強。 通過測定水稻組織砷形 態可見， ASA 能夠直接被水稻根吸收， 并可轉化 為 As （V）、 As （III）、 DMA、 MMA 形 態 分 布 在 水 稻 的 莖 ， 葉 ， 米 等 組 織 ， 較為系統地考察了 ASA 在水稻體內的歸趨特征。 由于大米中砷形態 比例發生了變化， 為此， 大米的食用安全性要以形 態分析為基礎更科學。 由于 iAs 毒性較大， 使水稻 的毒性增大， 再加上水稻植株中砷含量增加， 有必 要加大對 ASA 使用及畜禽糞便的監管。
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