昆山舒美對樹莓葉黃酮提取的正交試驗

黃酮類化合物作為抗氧化作用顯著的一類天然產物，其可應用于心腦血管疾病、腫瘤、炎癥等治療， 樹莓葉黃酮同樣具有應用價值及研究意義。目前樹莓葉提取物的研究主要包括樹莓葉中水楊酸、鞣花酸和黃酮，其中已有研究表明，樹莓葉黃酮分離組分主要包括蘆 丁、檞皮素和山奈酚衍生物，故本研究擬采用乙醇浸提法從樹莓葉中提取蘆丁等黃酮類成分，采用紫外分光光度法對所含總黃酮進行了測定，以及通過建立 ＨＰＬＣ 完成了 樹莓葉黃酮的初步分離，從而完成了黃酮中蘆丁含量的準確測定，為樹莓葉研發蘆丁獸用中藥制劑提 供理論參考。

紅樹莓葉，采自寧夏某樹莓種 植園；蘆丁 標 準 品，購自北京索萊寶科技有限公司 ；甲 醇、乙 醇、石 油 醚、乙 酸 乙 酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純試劑。

高效液相色譜儀，美國 Ｗａｔｅｒｓ公司產品；８４５３型紫外分光光度儀，美國 Ａｇｉｌｅｎｔ公 司 產 品；ＤＦＴ－２５０ 手 提 式 高 速 萬 能 粉 碎 機，溫嶺市林大機械有限公司產 品；電子分析天平（賽多利斯）；恒 溫 水 浴 鍋 （ＤＺＫＷ－Ｄ－２型），北京市永光明醫療儀器廠產品；旋 轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司產品；ＫＱ－ ５００型超聲波清洗器，昆山市超聲清洗儀器廠產品。

將樹莓葉經粉碎處理后，精 確稱重１００ｇ，加入乙醇加熱回流浸提后，取濾液經 石油醚、乙酸乙酯依次反復萃取，分離得最終乙酸乙 酯層棕紅色液體，經旋蒸儀蒸發至１００ｍＬ，置４ ℃ 冰箱保存。將各粗提物 取１０μＬ 溶 解 于 甲 醇，并 定 容至１０ｍＬ容量瓶，４ ℃保存備用。

準確稱 取 蘆 丁 標 準 品 ４．００ｍｇ，用甲醇定溶于１０ｍＬ的棕色容量瓶中，充 分搖勻，得到蘆丁質量濃度為０．４ｍｇ／ｍＬ的標準品 溶液，用０．４５μｍ 微孔濾膜過濾，４ ℃保存備用。

采 用 亞 硝 酸 鈉－硝 酸鋁比色法，以蘆丁為標準品在５１０ｎｍ 處測定吸光 度，以吸光度（ｙ）對各質量濃度（ｘ）進行線性回歸， 得回歸方程ｙ＝３２．６ｘ－０．００４９（Ｒ２＝０．９９９２），線 性范圍０．００２ｍｇ／ｍＬ～０．４ｍｇ／ｍＬ。

（ＨＰＬＣ）分離 利用反向色譜分離方法建立黃酮分離條件：ＡｇｉｌｅｎｔＺｏｒＢａｘＳＢ Ｃ１８色譜柱（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ，３．５μｍ），流動相為 １ｍｇ／ｍＬ乙酸－乙腈＝７２．５∶２７．５，等度分離，柱溫 ３０ ℃，檢測波長：２５７ｎｍ；以蘆丁為標準品建立標準 曲線，以色譜峰面積（ｙ）對各質量濃度（ｘ）進行線性 回歸，得 回 歸 方 程 ｙ＝４Ｅ＋０６ｘ＋２２１１９（Ｒ２ ＝ ０．９９９３），線性范圍０．００２ｇ／ｍＬ～０．４ｇ／ｍＬ。

通過選擇料液比（Ａ）、乙 醇濃度（Ｂ）、提取溫度（Ｃ）和提取時間（Ｄ）設計單因 素試驗設計（表１），考察各因素對黃酮提取率的影 響，每組試驗重復３次，取平均值。

通過選擇料 液 比（Ａ）、乙醇濃度（Ｂ）、提取溫度（Ｃ）和提取時間設計四因素三水平正交試驗和響應面設計試 驗，考察各因素對黃酮提取率的影響，每組試驗重復 ３次，取平均值。

２ 結果

測定結果 。 通 過 分 別 建 立 ＵＶ 和 ＨＰＬＣ色譜分離方法，對樹莓葉黃酮按照正交試驗和響應曲面試驗最佳工藝所得提取物，進行初步分 離，并對蘆丁含量進行準確測定和驗證，樹莓葉黃酮 中蘆丁實際含量為１．５１４ｍｇ／ｇ，占總黃酮粗提物含 量的１３．４％。

樹莓葉作為紅樹莓果樹的副產物，而 黃 酮 作 為藥用植物中普遍存在的天然活性成分，且樹莓葉的黃酮類化合物含量高于果實，蘆丁作為槲皮素 的一種糖苷衍生物，槲皮素和蘆丁已被證實具有 抗腫瘤、保護心腦血管等多種生物學活性。 本試驗通過建立 ＨＰＬＣ色譜分離方法，對樹莓 葉黃酮按照正交試驗和響應曲面試驗最佳工藝所得提取物，進行初步分離，并對蘆丁含量進行準確測定 和驗證。本 試 驗 最 佳 工 藝 所 得 樹 莓 葉 黃 酮 提 取 率 １１２７ ｍｇ／１００ ｇ，顯 著 高 于 徐 雅 琴 等報 道 的 ５３３．７１ｍｇ／１００ｇ，樹莓葉蘆丁的純化及獸用中藥制 劑工藝仍需進一步研究和探索。