超聲清洗器在仿生酶解有效部位的最佳脫脂工藝

白芪龍膠囊主要由白花蛇舌草、黃芪、天龍 等 5 味中藥組成，為自主研發的中藥六類新藥， 用于非小細胞肺癌等惡性腫瘤的輔助治療，初步 臨床應用取得了較滿意效果。前期研究發現， 采用獨特仿生酶解工藝制得的有效部位天龍小肽 抗腫瘤活性顯著，為白芪龍膠囊發揮“祛邪”作 用的關鍵成分，然而天龍藥材本身含有大量的油 脂成分(約 10%)嚴重干擾了天龍小肽的分級純化和后續的制劑成型。本實驗在文獻研究基礎上， 首次將固體石蠟法用于天龍油脂的脫除，重點對 固體石蠟法脫除有效部位天龍小肽中油脂的最佳 參數進行研究。

UV1100 型紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)；PHS-3C 型精密 pH 計(上海精密科學儀器有限公司)；KQ-250 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；TDL-5-A 型離心機(上海安亭科學儀器廠)；Millipore Labscale TFF 型超濾系 統(Millipore 公司)；HY-5 型回旋式振蕩器(金壇市億通電子有限公司)。

天龍，經山東中醫藥大學藥學院生藥教研室 李峰教授鑒定系壁虎科動物無蹼壁虎 Gecko swinhoana Guenther.的干燥全體；牛血清白蛋白(中 國食品藥品檢定研究院，批號：140619-201120)； 堿性銅試液、福林酚試液(按中國藥典 2015 年版四 部附錄 8002 項下配制)；高效切片石蠟(上海華永 石蠟有限公司，批號：20120801)；胃蛋白酶(國藥 集團化學試劑有限公司，酶活力≥1 200 U·g?1 ，批 號：F20070914)；胰蛋白酶(上海藍季科技發展有 限公司，酶活力 1 000~1 500 U·mg?1 ，批號： 091105)。

取天龍藥材，粉碎，過 50 目篩，加 10 倍量 去離子水，攪拌加熱至沸，放至室溫，用稀鹽酸 溶液調 pH 至 1.5~2.5，加入底物量 2%的胃蛋白酶 并攪拌均勻，37 ℃保溫振蕩 2 h，再用 10%氫氧 化鈉溶液調 pH 至 7.5~8.5，加入底物量 2%的胰蛋 白酶并攪拌均勻，50 ℃保溫振蕩 4 h，并時時調 pH，使 pH 保持在 8.0 左右，煮沸殺酶，放至室溫， 5 000 r·min?1 離心 15 min，分離上清液，微濾 (0.22 μm)，得天龍仿生酶解液，1 kg 藥材制得 10 L 酶解液。

精密量取一定體積的仿生酶解 液，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴鍋上 蒸干后，于 105 ℃干燥 3 h，置干燥器中冷卻 30 min，迅速精密稱質量，計算得膏率(得膏率=干 膏質量/酶解液相當生藥量×100%)。

以牛血清白蛋白為對照品，采用福林酚比色法測定酶解液中天龍總小 肽的含量。精密量取牛血清白蛋白對照品溶液 (0.225 4 g·L?1 ) 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 分 別置試管中，加水至 1.0 mL，加堿性銅試液 1.0 mL，搖勻，加入福林酚試液 4.0 mL，立即充 分混勻，置 55 ℃水浴中準確反應 5 min，馬上置冷水浴中 10 min，按照 UV 法，在 650 nm 處測 定吸光度。以牛血清白蛋白加入量為橫坐標，吸 光度為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為 Y=2.678 2X?0.022 8(r=0.998 4)，牛血清白蛋白加入 量在 0.045 08~0.225 4 mg 時線性關系良好。穩定 性、精密度、重復性試驗等方法學考察均符合規 定(RSD 分別為 1.12%，1.33%，1.06%)，平均加樣 回收率為 98.26%(n=6，RSD=1.93%)。精密量取適 當濃縮的仿生酶解液 1.0 mL，自“加堿性銅試液 1.0 mL”起依法測定吸光度，計算總小肽含量。

取天龍仿生酶解液 6 份，每份各 100 mL，分別稀釋 1 倍、不濃縮、 濃縮至 1︰1，2︰1，3︰1 和 4︰1(m︰V)，趁熱加 入相當天龍生藥量 30%的固體石蠟，加熱并攪拌 使完全熔化，保持微沸 5 min，靜置冷卻至室溫， 冷藏(2~6 ℃)過夜，濾過，分離石蠟層，加適量水 洗滌 1 次，合并濾液。取濾液適量，分別進行評 價指標測定，得膏率分別為 30.6%，30.9%，33.2%， 33.9%，34.2%，35.8%，小肽含量分別為 20.1%， 19.9%，18.1%，18.3%，17.5%，17.9%。結果表明， 隨著酶解液濃縮程度的增加，脫脂效果越差，且 有效成分損失嚴重(約 13%)，分析可能與石蠟層疏 松吸附有效成分、濾液黏稠呈混懸態等有關。綜 合考慮，確定對酶解液不濃縮直接進行脫脂處理。

取天龍仿生酶解液 6 份，每份各 100 mL，分別趁熱加入相當天龍生藥 量 10%，20%，30%，40%，50%，60%的固體石 蠟，加熱并攪拌使完全熔化，其余操作同“2.3.1” 項，測得得膏率分別為 37.7%，35.4%，30.2%， 28.4%，27.9%，28.8%；小肽含量分別為 19.2%， 18.8%，19.6%，20.9%，20.5%，21.3%。結果表明， 當石蠟用量≥40%時，濾液澄清，石蠟層分離徹底， 得膏率基本穩定在 28%左右，說明除脂徹底且無 石蠟殘留；同時，有效成分的含量不受石蠟用量 的影響，穩定在 20%左右，因此暫定石蠟用量為 40%，待進一步考察。

取天龍仿生酶解液 6 份， 每份各 100 mL，趁熱加入相當天龍生藥量 40%的 固體石蠟，加熱并攪拌使完全熔化，保持微沸 5 min，靜置冷卻至室溫，分別冷藏(2~6 ℃) 2，4， 6，8，10，12 h，濾過，其余操作同“2.3.1”項， 測得得膏率分別為 30.9%，29.7%，25.2%，25.4%，24.9%，25.6%；小肽含量分別為 15.2%，16.4%， 18.2%，18.1%，18.7%，17.9%。結果表明，當冷 藏放置時間≥6 h 時，得膏率不再顯著變化，基本 維持在 25%左右，小肽含量在 18%左右，說明油 脂已完全除去，且有效成分損失較少，因此暫定 冷藏時間為 6 h，待進一步考察。

取天龍仿生酶解液 5 份， 每份各 100 mL，趁熱加入相當天龍生藥量 40%的 固體石蠟，加熱并攪拌使完全熔化，保持微沸 5 min，靜置冷卻至室溫，分別在 2，4，6，8，10 ℃ 下冷藏 6 h，濾過，其余操作同“2.3.1”項，測得 得膏率分別為 26.5%，25.6%，26.1%，31.8%， 36.7%；小肽含量分別為 19.0%，19.4%，19.3%， 17.5%，16.2%。結果表明，冷藏溫度是決定石蠟 層成型的關鍵因素，溫度過高，石蠟凝固不充分， 油脂無法被石蠟充分溶出；當溫度≤6 ℃時，得 膏率和小肽含量分別維持在 26%和 19%左右，有 限時間內石蠟層凝固充分，油脂去除完全，有效 成分幾乎無損失，因此暫定冷藏溫度為 2~6 ℃， 待進一步考察。

取天龍仿生酶解液 6 份，每份各 100 mL，趁熱加入相當天龍生藥量 40%的固體石蠟，加熱并攪拌使完全熔化，保持微 沸 5 min，靜置冷卻至室溫，冷藏(2~6 ℃) 6 h，濾 過，分離石蠟層，分別加適量水洗滌 0，1，2，3， 4，5 次，合并濾液。取濾液適量，分別進行評價 指標測定，得膏率分別為 25.7%，27.8%，28.2%， 28.5%，28.1%，28.6%；小肽含量分別為 18.9%， 20.2%，20.6%，21.0%，20.9%，20.5%。結果表明， 石蠟層對有效成分的吸附較少，水洗 2 次即可洗 滌完全，因此確定石蠟層的水洗次數為 2 次。

取天龍仿生酶解液 4 份， 每份各 100 mL，趁熱加入相當天龍生藥量 40%的 固體石蠟，加熱并攪拌使完全熔化，保持微沸 5 min，靜置冷卻至室溫，冷藏(2~6 ℃) 6 h，濾過， 分離石蠟層，加適量水洗滌 2 次，合并濾液，分 別進行重復脫脂操作 0，1，2，3 次。取濾液適量， 分別進行評價指標測定，得膏率分別為 28.2%， 27.3%，27.0%，27.2%；小肽含量分別為 21.0%， 20.9%，19.6%，19.8%。結果表明，按照上述優選 的最佳工藝參數進行脫脂處理，脫脂 1 次即可將 油脂脫除干凈，且隨著脫脂次數的增多，有效成 分含量有降低趨勢；綜合考慮，確定石蠟脫脂次數為 1 次。

根據藥物性質和實際 實驗條件，分別選擇低溫冷藏法、乙醇沉淀法和 固體石蠟法進行了預實驗考察。結果發現，低溫 冷藏法脫脂效果差，不能達到徹底去除；乙醇沉 淀法對有效成分(天龍小肽)的損失較多；而固體石 蠟法充分利用石蠟熱熔冷凝、親油疏水的特性， 工藝操作簡便易行、成本低、周期短、脫脂效果 較好，因此對固體石蠟法脫油脂進行了重點研究。 實驗中發現，固體石蠟在加入熱酶解液前宜加工 成細粉，便于其迅速熔化，避免熔化不均勻現象， 降低除脂效率；另外，在石蠟完全熔化與酶解液 充分混勻后冷卻至室溫的過程中，嚴禁攪拌，否 則石蠟層會疏松黏軟，冷凝不完全，不僅除脂效 果差，而且會有石蠟殘留。

本研究采用福林酚比色法(又稱 Lorry 法)測定 天龍仿生酶解液中總小肽的含量，其測定原理是蛋白質或多肽與堿性銅溶液中的 Cu2+絡合形成銅蛋白質/多肽復合物，此復合物與福林酚試劑反應， 產生藍色化合物，該藍色化合物在波長 650 nm 處 的吸光度與蛋白質/多肽中的酪氨酸和色氨酸的含 量成正比，根據供試品的吸光度，計算供試品中 蛋白質/多肽的含量。研究表明，福林酚試劑只有 在酸性條件下穩定，而銅-蛋白質/多肽復合物的顯 色反應在堿性條件下進行，因此，實驗中加入福 林酚試劑后應立即充分混勻，否則顯色能力會下 降，從而影響測定結果。另外，實驗所用堿性銅 溶液要現用現配，否則容易出現沉淀，影響實驗結果。