基于生物信息學途徑挖掘防治急性高原病的潛在

急進高原后急性高山病( AMS) 的發病率居高 不下，其中高原心臟疾病是很重要的一部分。文 獻報道，高原環境運動者 30% 的死亡與高原心臟病 猝死相關。高原心臟病的發生發展比較復雜， 尤其對急進高原后心臟的影響還不甚清楚。前 期實驗中，我們應用低氧實驗艙模擬海拔 7000 m 高 原環境，應用超聲心動圖評估了 SD 大鼠在急進高 原后不同時間點( 3 d、7 d、14 d、28 d) 心臟結構和功 能變化，HE 染色病理切片評估了心肌組織病理變 化。發現急性高原低氧可造成大鼠心肌組織水腫， 心臟收縮和舒張功能嚴重受損。急進高原第 7 天時 大鼠心臟收縮功能受損最嚴重。目前國內外對 于 AMS 發生機制尚不十分明確，還沒有非常有效的 干預策略。雖然很多研究已證實炎性因子、氧化應 激等在急性高原病發生發展過程中起著重要作用， 但均不足以從基因水平全面闡述急性高原病發生機 制，也不足以篩選新的防治急性高原病的藥物。本 研究擬通過低壓氧艙模擬高原低氧環境，建立急性 高原病大鼠動物模型。通過對高原低氧暴露 7 d 大 鼠心肌組織進行全轉錄組測序，篩選與急性高原病 相關的差異表達基因。應用 Connectivity Map 數據 庫對差異表達基因進行分析比對，通過生物信息學 方法篩選潛在的防治急性高原病的藥物。

選取 6 周齡 SPF 級 SD 大鼠，體質量( 200 ± 20) g，雄性，由昆山超聲儀器有限公司提供。許 可 證 號: SCXK ( 京) 2016-0006。所有動物實驗均通過倫理委員會審核。 采用隨機數字表法將 SD 大鼠分為高原低壓低氧實 驗組( HH 組) 、常壓常氧對照組( con 組) 、藥物干預 組( Sb203580 組) 。每組 20 只動物。

應用實驗艙(貴州風雷航空軍械有限責任公司) 模擬高原低氧條件。實 驗艙參數設定: 模擬海拔高度7000 m，升降速度 10 m / s，艙內壓力 39． 1 kPa，艙內氧氣壓力 9． 022 kPa。 實驗組和藥物干預組大鼠均置于實驗艙內。實驗艙 運行時間 23 h / d，晝夜比 12 h∶ 12 h。每日上午開 倉 1 h 更換墊料、飼料、飲用水。藥物干預組大鼠于 每天開倉時腹腔注射 SB203580 溶液 ( 10 mg / kg) ， 每日注射 1 次，每只大鼠連續注射 7 d。對照組大鼠 置于實驗艙外，處理等同于實驗組大鼠。

ＲNA 提取 各組大鼠飼養 7 d 后處死，開胸取出心臟。應用 Trizol 試劑提取心 肌組織總 ＲNA。取 100 mg 心肌組織樣品，加入 1 mL ＲNAstore 樣本保存液。按照 Trizol 試劑說明書， 一步法提取心肌組織總 ＲNA。采用 ＲNeasy Mini Kit 純化總 ＲNA，應用 NanoDrop2000 分光光度計分別 測量 ＲNA 在波長為 260 nm、280 nm 的吸收值，間接 計算出提取的 ＲNA 濃度。使用 2% 瓊脂糖凝膠電 泳檢測 ＲNA 純度和完整性。

mＲNA 高通量測序 質檢合格的 ＲNA 進行文庫構建。使用 HiSeq2500 進行全 轉錄組高通量測序( 實驗組和對照組各 6 只動物) ， 獲得 mＲNA 表達譜。使用 FastQC 對原始序列進行 檢測，保留高質量的整潔序列( clean reads) 。使用 Cufflinks 2． 0 對所有轉錄組結果進行匯總整合，并 使用 Ensemble 轉錄本數據庫對獲得的結果進行注 釋。使用 Cufflinks 軟件篩選差異基因。差異基因的 篩選標準為同時滿足以下條件: ①在兩個樣本中測 序讀數之和》10 的基因; ②滿足│log2 ( FC) │ ＞ 1 ( 上調 2 倍或下調 2 倍) ; ③同時滿足 P ＜ 0． 05 和 FDＲ( false discovery rate) ＜ 0． 05。高通量測序檢測 由北京博奧公司完成。

GO 分類和 Pathway 分析 應用 SAM 軟件篩選出實驗組和對照組比較，相對表達超 過 2 倍的差異基因。應用可視化和整合發現的數據 庫( DAVID ) 軟件對差異基因功能進行基因本體 ( GO) 分類、生物學通路( Pathway) 分析、功能注釋聚 類分析，獲得差異基因相關功能的功能富集類。

藥物數據庫篩選與高原低 氧作用機制拮抗的藥物 應用生物信息學工具 ConnectivityMap 數據庫，整合差異表達 mＲNA 信息， 推測高原低氧相關心肌損傷中差異表達基因與藥物 小分子功 能 的 關 系。將 比 對 系 數 OＲ ＜ 1 且 P ＜ 0． 05的藥物定義為具有防治急性高原病的效應。

各組動物完成實驗 處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS 溶液漂洗，濾紙吸干。用電子天平稱量心臟濕質量 后，置于 80 ℃恒溫干燥箱烘干 48 h 至恒質量，稱重 心臟干質量。計算組織含水量 = ( 濕重 － 干重) /濕 重 × 100% 。

各組動物完成實驗 處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS 溶液漂洗，濾紙吸干。組織用 40 mL /L 多聚甲醛溶 液固定 24 h，常規脫水，石蠟包埋，連續切 5 片，片厚 約 4 μm，HE 染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌 組織病理學變化。

AQP1 mＲNA 檢測 應用 real time PCＲ 技術檢測心肌組織 AQP1 mＲNA 表達。通過 Ｒeverse Transcription Kit 試劑盒將心肌組織 ＲNA 逆 轉錄為 cDNA，使用熒光定量 PCＲ 試劑盒進行 AQP1 mＲNA 相對表達水平測定。檢測總體系為 25 μL ( 其中上下游引物各 0． 5 μL、Premix 12． 5 μL，cDNA 模板 2 μL、ddH2O 9． 5 μL) 。PCＲ 程序參照試劑盒中提供的兩步法檢測: 95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環。各組實驗獨立重復 3 次。以 β-actin 作為內參基因，采用 2-ΔΔCt法計算 mＲNA 相對表 達量，引物由上海生工合成。AQP1 上游引物為 5’- GCCAGCGAGTTCAAGAAG-3’，下 游 引 物 5 ’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。β-actin 上游引物為 5 ＇-TTCGCGGGCGACGATGC-3 ＇，下 游 引 物 為 5 ＇- CGAAGTCCAGGGCGAC-3＇。

采用 SPSS 16． 0 統計軟件進行 分析。計量資料以 x ± s 表示，進行正態分布和方差 齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，兩組 間差異采用獨立樣本 t 檢驗。P ＜ 0． 05 為差異有統 計學意義。

將相對表達量 比值在 2 倍以上，且差異有統計學意義( P ＜ 0． 05) 的 mＲNA 作為差異表達 mＲNA。與對照組比較，高 原低氧實驗組大鼠心肌組織中 1 084 個 mＲNA 表達 發生顯著變化。其中 457 個 mＲNA 表達上調，627 個 mＲNA 表達下調 。