昆山超聲儀器在高效液相色譜法測定中的使用

科舒筋洗劑在本院沿用有近 20 年 , 是本院制劑中的 拳頭制劑。該制劑療效確切 , 廣泛用于臨床 , 使用量逐年增 長 , 得到臨床和患者高度的認可 , 臨床主要用于跌打損傷、 勞損、腰頸椎病、骨關節炎以及骨折恢復期等的外洗、熏蒸 治療。其主要由兩面針、蘇木、黃柏、荊芥、 鉤藤、透骨 草、威靈仙、千年健、 北劉寄奴、寬筋藤 10 味中藥組成 , 具 有活血散瘀、舒筋通絡作用 , 常用來治療跌打損傷、瘀血等。 該制劑現行標準僅對蘇木、黃柏進行定性鑒別, 對于其含 量檢測目前尚無標準 , 導致無法全面有效地控制外科舒筋洗 劑的質量。黃柏在外科舒筋洗劑處方中為臣藥 , 鹽酸小檗堿 為黃柏主要有效成分, 故本文擬探索采用高效液相色譜法 建立該制劑中鹽酸小檗堿的含量測定方法 , 并測定外科舒筋 洗劑中鹽酸小檗堿的含量, 旨在為控制其質量標準提供 客觀定量的評價方法 , 提高該制劑質量標準 , 為日常生產提 供檢驗依據 , 現具體報告如下。

美國安捷倫公司 Agilent-1200 型高效液相色譜 儀 , 包括安捷倫四元泵 , 安捷倫在線脫氣機 , 安捷倫紫外檢測 器等 ；安捷倫色譜柱 ( 型號 ：Eclipse Plus 填料 ：C18) ；德國賽多利斯公司電子天平 , 昆山超聲儀器有限公司 KQ-250DA 型數控型超聲波清洗器 ( 功率 250 W, 頻率 40 kHz)。

乙腈 ( 色譜純 , TEDIA), 磷酸二氫鉀 ( 廣州化學 試劑廠 20170701-1), 水為超純水 ；鹽酸小檗堿對照品 ( 批號：110713-2011814 供含量測定用 ) 購自中國藥品生物制品檢定 所 , 含量為 86.7%；外科舒筋洗劑 ( 河源市中醫院提供 3 批次： 批號 ：181001、181002、181101)。

對照樣品溶液的配制 ：以電子分析天平稱取鹽酸小檗堿對照品 10.02 mg 于 100 ml 量瓶中 , 然 后加甲醇溶液將其溶解并稀釋至刻度 , 作為貯備液 , 精密量 取貯備液 5 ml 于 25 ml 量瓶中 , 同樣以甲醇溶液稀釋至刻度 后即為對照樣品液 ；供試品溶液的配制 ：取外科舒筋洗劑溶液過濾后 , 精密量取 20 ml, 蒸干 , 加甲醇溶液使其溶解 ( 必 要時可用超聲方法溶解 ) 并轉移至 50 ml 量瓶中 , 加甲醇溶 液至刻度 , 即得供試品溶液 ；陰性對照品溶液液的配制 ：按 質量標準中規定的處方比例同法配制不含黃柏的陰性樣品 , 按供試品溶液配制方法配制成相應的陰性對照品溶液。

以 Agilent Eclipse Plus C18 (250.0 mm×4.6 mm, 5 μm) 為填充柱 , 流動相為乙腈 -0.03 mol/L 磷 酸 二 氫 鉀 溶 液 (28∶72), 檢測波長為 347 nm, 流速為1.0 ml/min, 進樣量為 10 μl ；以峰面積外標法定量。在本色譜 條件下 , 外科舒筋洗劑中鹽酸小檗堿對照品的色譜峰與其他 組分峰均取得較好分離 , 干擾性較小。

分別取對照品溶液、樣品溶液、陰性 對照液 , 按上述色譜條件進樣測繪高效液相色譜法圖譜 , 組 分的出峰時間區域相互分離 , 未發現明顯干擾峰 , 結果表明 處方中其他成分及輔料對鹽酸小檗堿的測定無干擾作用。見 圖 1。

2. 4 線性關系的考察　

分別精密量取鹽酸小檗堿對照品儲備液 1、3、5、7、9、11 ml, 置 于 25 ml 量 瓶 中 , 通 過甲醇定容至要求刻度 , 充分搖勻后得到一系列標準溶 液。 按 上 述 色 譜 條 件 分 別 進 樣 10 μl, 測 定 峰 面 積 , 以 峰 面積 (A) 為縱坐標 , 鹽酸小檗堿對照品濃度 (C) 為橫坐標 繪制標準曲線 , 進行線性回歸 , 計算得回歸方程。鹽酸小 檗 堿 A=29.63C+45.743(r=0.9912), 結果表明鹽酸小檗堿在 3.4749~38.2243 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

外科舒筋洗劑為本院院內制劑 , 具 有活血散瘀、舒筋通絡之功效 , 臨床用來治療跌打損傷、瘀 血等疾病 , 臨床應用多年 , 效果顯著。外科舒筋洗劑原標準 僅對蘇木、黃柏進行定性鑒別 , 不符合質量標準提升要求 , 對其日常生產質量也難于監控。本試驗曾經嘗試對兩面針中 氯化兩面針堿進行含量測定 , 但供試品峰面積偏小 , 考慮 現有工藝中該成分提取率不高, 故不再選擇兩面針作為研 究對象。黃柏在該制劑處方中為臣藥 , 其具有清熱、消腫、 止痛等作用 , 與兩面針等其他藥發揮活血散瘀、舒筋通絡止 痛之功效。黃柏主要以鹽酸小檗堿為主要有效成分。在 上述試驗條件下 , 經試驗證實 , 鹽酸鹽酸小檗堿試驗分離度 和重復性較好 , 且陰性無干擾 , 故選擇其為研究對象。

經在線全波長紫外吸收光譜掃描分 析 , 鹽酸小檗堿在 265 nm 和 347 nm 波長處有最大吸收波長。 若采用 265 nm 作為檢測波長時 , 鹽酸小檗堿的分離效果較差 , 分離度達不到要求；而采用 347 nm 作為檢測波長時 , 鹽酸小檗堿的分離度好 , 峰形良好。且其他物質對測定無干 擾。最終采用 347 nm 作為檢測波長。

提取方法可選取甲醇、甲醇 - 鹽酸 (100∶1) 兩種溶劑分別進行提取 , 結果并無明顯差別 , 但從 操作方法的簡便方面考慮 , 選取甲醇提取鹽酸小檗堿。

作者曾對不同流動相體系條件的實驗 效果分別進行了考察 , 分別比較乙腈 -0.1% 磷酸溶液 ( 每 100 ml 加十二烷基磺酸鈉 0.1 g) 及乙腈 -0.03 mol/L 磷酸二氫鉀溶液為流動相的效果 , 結果表明 , 兩者結果并無明顯 差別 , 從操作方法的簡便及環境保護方面考慮 , 選取乙腈 -0.03 mol/L 磷酸二氫鉀溶液作為流動相。

通過對不同時間生產 3 批 外科舒筋洗劑進行鹽酸小檗堿含量的測定 , 結果顯示差異 小 , 說明該制劑生產工藝穩定 , 在制訂內控標準或者提高 該制劑標準 , 可暫定外科舒筋洗劑的黃柏以鹽酸小檗堿計 , ≥30 μg /ml。

綜上所述 , 本研究建立測定外科舒筋洗劑中鹽酸小檗堿 含量方法 , 經過方法學驗證 , 所建立的測定方法符合定量分 析要求 , 最終確定以 347 nm 為檢測波長 , 甲醇為提取液 , 乙 腈 -0.03 mol/L 磷酸二氫鉀溶液為流動相 , 測定結果顯示該法 簡便、準確、快速、分離度好 , 重復性好 , 干擾小 , 可用于 外科舒筋洗劑的質量控制。