柴胡疏肝散入血含量的分析-KQ-3200使用

中醫藥是中國傳統文化的寶貴財富和傳統醫學 的精華，中藥治療具有豐富的臨床經驗和獨特的理論體系，正逐漸受到國際社會越來越多的認識和關 注，所以中醫藥現代化研究是當前研究的主要熱點， 把現代科學技術應用于中醫藥學領域，是中醫藥科 學化的必經之路。

1 研究資料

1. 1 實驗動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 20 只，購自北 京維通利華實驗動物技術有限公司，合 格 證 號: SCXK(京)2014 － 0004，體質量 180 ～ 200 g，飼養于 首都醫科大學附屬北京友誼醫院實驗動物中心，常 規條件喂養，溫度 22 ℃，濕度 30% ～ 40% ，光照 12 h (8:00—20:00)，噪聲 ＜ 60 dB。

1. 2 藥品及試劑

柴胡疏肝散，方中各味中藥由首 都醫科大學附屬北京友誼醫院中藥房提供，經中藥 專家鑒定符合《中國藥典》2005 版要求 。甲醇和乙 腈(HPLC 級，美國 Fisher 公司)，其他試劑均為分析 純(國藥集團化學試劑有限公司)。實驗用水為經 Milli － Q 凈化系統過濾的去離子水。

1. 3 主要儀器

Agilent 1290 UPLC － 6540 accurate mass Q － TOF 色譜 － 質譜聯用儀，配置 MassHunter 質譜工作站和 MPP 軟件 工 作 站( 美 國 Agilent 公 司);CF16ＲXII 離心機(日本 Hitachi 公司);SAS 渦 旋混合器(英國 Stuart 公司);KQ3200 超聲波清洗器 (昆山舒美超聲儀器有限公司);Milli － Q 超純水制備儀 (美國 Millipore 公司);分析天平(瑞士 Mettler)。

1. 4 色譜條件

Water HSS T3 色譜柱(100 mm × 2． 1 mm，1． 8 μm);流動相由 A 相(含 0． 1% 甲酸水 溶液)和 B 相(0． 1% 甲酸乙腈溶液)組成，梯度洗脫 程序:0 ～ 20 min，10% B→90% B;20 ～ 25 min，90% B;25 ～25． 1 min，90% B→10% B;25． 1 ～ 30 min，10% B。流速:0． 20 mL /min;柱溫:30 ℃;進樣量 5 μL。

1. 5 質譜條件

電噴霧離子源(Dual ESI);霧化器(N2)壓力 40 ( psig);輔助氣(N2) 流速 10 L /min; Fragment 電 壓 175 V; 掃 描 質 量 范 圍 M/Z 100 － 1700，掃描速度 1 specra /s，掃描模式為 full － mass 全掃描。正離子掃描毛細管電壓為 4． 0 kV，輔助器 溫度為 350 ℃ ;負離子掃描毛細管電壓為 3． 5 kV，輔 助器溫度為 320 ℃。

1. 6 柴胡疏肝散灌胃液制備方法

取處方量陳皮 12 g、柴胡 12 g，川芎 9 g、香附 9 g、枳殼 9 g、芍藥 9 g， 炙甘草 3 g，加 10 倍量水浸泡 1 h 后，煎煮 6 h，紗布 過濾，加入 8 倍量水煎煮 4 h，合并 2 次濾液，真空濃 縮干燥，得浸膏(1 g 浸膏相當于原藥 1． 125 g)。稱 取適量，蒸餾水溶解，即得柴胡疏肝散灌胃藥液。

1. 7 血清樣品制備方法

含藥血清樣品制備:取同 批次雄性 SD 大鼠 10 只禁食不禁水 12 h，給予柴胡 疏肝散藥液 1． 5 mL /100 g 灌胃，給藥 2 h 后，10% 水 合氯醛麻醉大鼠，自大鼠眼眶后靜脈叢取血 2 mL 于 含抗凝劑 EP 管中，全血以 4 000 r/min 離心 15 min， 取血清樣品，用 4 倍體積冰冷的甲醇提取，12 000 r/ min 離去 10 min，去除蛋白質以及較大的脂質，取上 清液蒸發至干，重新溶于 50 μL 10% 乙腈水溶液中， 即得含藥血清。空白血清樣品制備:取同批次雄性 SD 大鼠 15 只禁食不禁水 12 h，給予與柴胡疏肝散 藥液相同體積的生理鹽水灌胃，其余處理方法同含 藥血清制備。

1. 8 入血成分分析方法

取含藥血清樣品、空白血 清樣品及柴胡疏肝散水煎劑樣品，行 UPLC － QTOF (儀器型號 agilent 1290 － 6540)檢測，正負離子模式 各檢測 1 遍。采集的數據使用 MassHunter 質譜工 作站和 MPP 軟件進行分析，主要包括提取分子特 征、MPP 遞歸分析、通過離子查找化合物、MPP 軟件 差異分析 4 個步驟，建立 UPLC 色譜圖。通過對數 據的保留時間、精確質量數進行校準、過濾，找出各 組不同樣品之間的差異成分。然后通過本實驗室的 中藥成分數據庫(TCM Database)對正離子模式、負 離子模式化合物進行搜庫，找到中藥類化合物。對柴胡疏肝散藥材含有的化合物 成分進行總結，找出其共有的成分，即為可能入血的 藥材成分。

2 結 果

入血成分為柴胡疏肝散水煎劑中及柴胡疏 肝散灌胃大鼠血清中均含有的成分，右上圓圈部分 為柴胡疏肝散藥材中采集到的化合物，左上圓圈部分為柴胡疏肝散灌胃大鼠血清中采集到的化合物， 而中下圓圈部分為空白組大鼠血清中采集到的化合 物，左上圓圈和右上圓圈的交集不包含中下圓圈交 集的部分即為可能的入血成分。

3 討 論

中藥復方組成復雜，各種組分物理化學性質各 異，不同的制備方法(如溫度、pH 值等)、不同的產 地、不同時期采摘等都會影響中藥復方中有效成分 含量，甚至影響療效。用現代科學技術研究和發展 中藥，必須著眼于中藥藥效物質基礎的研究。但傳 統方法如色譜、光譜等技術得到的藥物成分很可能 只是一般化學成分，或可能只是活性成分的前體物 質，多數中藥或復方現行質量標準中測定的所謂 “有效成分”多為主要藥物的主要成分或指標性成 分，并無充分依據證明其為有效成分。而UPLC法涵蓋了小顆粒填料、非常低系統體積及快速檢測手 段等全新技術，與高效液相色譜法(HPLC)相比，還 增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，具有分析 速度快、分離效率高、檢測靈敏度高等優點，可通 過檢測分析不同配伍中藥加工過程中有效物質成分 的變化及相互影響，較好地探索中藥復方配伍規律 及其作用機制。

 

免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯系我們，我們會在第一時間進行處理。