復(fù)方菝葜顆粒化學模式識別研究（KQ500DE使用）

復(fù)方菝葜顆粒（ＣｏｍｐｏｕｎｄＲｈｉｚｏｍｅＳｍｉｌａｃｉｎｕｓＧｒａｎｕｌｅ，ＣＲＳＧ）是“湖南國華制藥有限公司”具有獨 家知識產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤制劑，該制劑由菝葜、魚腥草、貓爪草、款冬花、土鱉蟲、枸杞子、大棗七味中藥材和鮮 鱧魚組成，為臨床癌癥輔助治療的常用藥物。現(xiàn)有研究表明，ＣＲＳＧ 具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和增 強機體免疫等活性，適宜用于改善非小細胞肺癌、子宮頸癌伴有咳嗽、胸痛、帶下異常等癥狀，該藥可供多 種癌癥的輔助治療運用。

１ 實驗部分

１．１ 儀器、試劑及材料

１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ型高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技公司）；ＡＬ２０４電子分析天平（梅特勒－托利多公司）； KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；冷凍干燥機（寧波雙嘉儀器有限公司）。 綠原酸對照品（純度≥９９．３９％，批號：ＭＵＳＴ－１７０３０６２０）購自成都曼斯特生物科技有限公司；落新婦 苷對照品（純度≥９８％，批 號：１ＤＢＧ－ＱＨＴＲ）購自中國食品藥品檢定研究 院；新 綠 原 酸 對 照 品（純 度≥ ９８％，批號：ＣＨＢ１７０９１４）、隱綠原 酸 對 照 品（純 度≥９８％，批 號：ＣＨＢ１７０８２８）、金 絲 桃 苷（純 度≥９８％，批 號：ＣＨＢ１６０９０４）、異槲皮苷（純度≥９８％，批號：ＣＨＢ１６０９１２）、３，５－二咖啡酰奎寧酸對照品（純度≥９８％， 批號：ＣＨＢ１７１０１３）、３，４－二咖啡酰奎寧酸對照品（純度≥９８％，批號：ＣＨＢ１６０７２５）、４，５－二咖啡酰奎寧 酸對照品（純度≥９８％，批號：ＣＨＢ１６０７２６）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲酸和甲醇均為色譜 純（美國 ＴＥＤＩＡ 公司），其余試劑均為分析純，水（華潤怡寶飲料（長沙）有限公司）。 經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，菝葜為百合科植物菝葜Ｓｍｉｌａｘｃｈｉｎａ Ｌ． 的干燥根莖；魚腥草為二白草科植物蕺菜 ＨｏｕｔｔｕｙｎｉａｃｏｒｄａｔａＴｈｕｎｂ．的新鮮全草或干燥地上部分；貓爪 草為毛莨科植物小毛莨ＲａｎｕｎｃｕｌｕｓｔｅｒｎａｔｕｓＴｈｕｎｂ．的干燥塊根；枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Ｌｙｃｉｕｍ－ ｂａｒｂａｒｍ Ｌ．的干燥成熟果實；大棗為鼠李科植物棗Ｚｉｚｉｐｈｕｓｊｕｊｕｂａ Ｍｉｌｌ．的干燥成熟果實；款冬花為菊 科植物款冬 Ｔｕｓｓｉｌａｇｏｆａｒｆａｒａ Ｌ．的干燥花蕾；土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉 Ｅｕｐｏｌｙｐｈａｇａｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｗａｌｋｅｒ 或冀地鱉ＳｔｅｌｅｏｐｈａｇａＰｌａｎｃｙｉ（Ｂｏｌｅｎｙ）的雌蟲干燥體。復(fù)方菝葜顆粒（湖南國華制藥有限公司，批號依 次為Ｓ１：２０１７０９０１、Ｓ２：２０１７０９０２、Ｓ３：２０１７１２０１、Ｓ４：２０１７１２０２、Ｓ５：２０１８０３０１、Ｓ６：２０１８０３０２、Ｓ７：２０１８０３０３、 Ｓ８：２０１８０４０１、Ｓ９：２０１８０４０２、Ｓ１０：２０１８０４０３）。

１．２ 色譜條件

色譜柱：ＥＣ－Ｃ１８柱（５０×３．０ｍｍ，２．７μｍ）；流動相：Ａ 為甲醇，Ｂ為０．３％甲酸水溶液。梯度洗脫程 序：０～２ ｍｉｎ，２％Ａ；２～５ ｍｉｎ，２％ ～７％Ａ；５～１２ｍｉｎ，７％ ～１１％Ａ；１２～１５ｍｉｎ，１１％ ～１４％Ａ；１５～ １７ｍｉｎ，１４％～１６％Ａ；１７～１８ｍｉｎ，１６％～１８％Ａ；１８～２０ｍｉｎ，１８％～２０％Ａ；２０～２１ｍｉｎ，２０％～２４％Ａ； ２１～２４ｍｉｎ，２４％～２６％Ａ；２４～２８ｍｉｎ，２６％～２８％Ａ；２８～２９ｍｉｎ，２８％Ａ；２９～３０ｍｉｎ，２８％～３１％Ａ；３０ ～３５ｍｉｎ，３１％～４８％Ａ；３５～３８ｍｉｎ，４８％Ａ。體積流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫：２５℃；進樣量：２μＬ；檢測波 長：２８０ｎｍ。

１．３ 溶液的制備

１．３．１ 對照品溶液

取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異槲皮苷、金絲桃苷、落新婦苷、３，４－二咖啡酰奎寧 酸、３，５－二咖啡酰奎寧酸，４，５－二咖啡酰奎寧酸各對照品適量，加適量甲醇制成含綠原酸９０μｇ／ｍＬ、新 綠原酸１０２．７μｇ／ｍＬ、隱綠原酸７２．８μｇ／ｍＬ、金 絲 桃 苷１０１．８μｇ／ｍＬ、落 新 婦 苷１３３μｇ／ｍＬ、異 槲 皮 苷 １０４．８μｇ／ｍＬ、３，４－二咖啡酰奎寧酸２１７．８μｇ／ｍＬ、３，５－二咖啡酰奎寧酸９３．２μｇ／ｍＬ，４，５－二咖啡酰 奎寧酸９５．５μｇ／ｍＬ的對照品溶液。

１．３．２ 供試品溶液

精密稱取復(fù)方菝葜顆粒１．０ｇ，加甲醇定容至１０ｍＬ，稱重后密閉，于２５０ Ｗ、４０ｋＨｚ 超聲溶解，放冷后，加甲醇補足失重，搖勻，過濾，取濾液用０．２２μｍ 濾膜過濾，得到復(fù)方菝葜顆粒提取物， 備用。

１．３．３ 單味藥材供試品溶液

精密稱取菝葜、魚腥草、貓爪草、枸杞子、大棗（去核）各１５ｇ，款冬花、土鱉 蟲各５ｇ，第一次加９４０ｍＬ水（煎煮１．５ｈ），第二次加７５２ｍＬ水（煎煮１ｈ），合并煎煮液，濃縮，利用冷凍 干燥儀干燥，得浸膏，備用。

１．４ 方法學考察

１．４．１ 精密度試驗

取同一供試品溶液（Ｓ１），連續(xù)進樣６次，記錄色譜指紋圖譜，選擇出峰穩(wěn)定、峰面積 較大、響應(yīng)值最高、分離度良好的８號峰（綠原酸）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積 的相對標準偏差（ＲＳＤ）均低于２％，表明儀器精密度良好。

１．４．２ 重復(fù)性試驗

分別取 ＣＲＳＧ（Ｓ１）６份，按照１．３．２方法制備供試品溶液，按照１．２色譜條件進行檢 測，記錄指紋圖譜，以８號峰（綠原酸）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積 ＲＳＤ 均低于 ２％，表明該方法重復(fù)性良好。

１．４．３ 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（Ｓ１），分別于０、４、８、１２、１６、２４ｈ進樣檢測，記錄指紋圖譜，以８號 峰（綠原酸）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積 ＲＳＤ 均低于２％，表明供試品溶液在 ２４ｈ 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

２ 結(jié)果與討論

按照１．３．２方法制備１０批次樣 品的供試品溶液，各取２μＬ 在１．２色 譜 條 件 下 進 行 色 譜 峰采集，得到１０批ＣＲＳＧ 的指紋圖譜。確定１８個 色譜峰為１０批 ＣＲＳＧ 所共有。使用“中藥色譜指 紋 圖 譜 相似度評價系統(tǒng)（２０１２Ａ 版）”軟件計算模擬得到對照色譜 圖（Ｒ）。以８號峰（綠原酸）為參照色譜峰（Ｓ），計 算１０批 ＣＲＳＧ 各個色譜峰的相對保留時間。 結(jié)果顯示，不同批次間各共有峰的保留時間ｔＲ和相對峰面 積的 ＲＳＤ大部分均在１％左右，初步判斷１０批復(fù)方菝葜 顆粒樣品成分較穩(wěn)定，但仍存在一定差異。取１．３．１項下制備的除鮮鱧魚外的其余７味藥材樣品，分別精密吸取２μＬ進樣并記 錄 ＵＰＬＣ色譜圖，確認復(fù)方菝葜顆粒 ＵＰＬＣ指紋圖譜的１８個特征峰的來源。７種單味藥材對復(fù)方 菝葜顆粒 ＵＰＬＣ指紋圖譜均有貢獻，其中２、４、５、７、８、１０、１２～１６號峰來自菝葜，２號峰來自魚腥草，１、３、９ 號峰來自貓爪草，５、７、９、１３、１４、１７、１８號峰來自款冬花，１和６號峰來自枸杞子，１１號峰來自大棗。其中 不同的單味藥材有多個共有峰，表明中藥材中其成分的復(fù)雜性。菝葜和款冬花擁有多個不同的共有峰，表 明了這２味藥材對于整個復(fù)方的化學成分的重要性。采用相似 度 軟 件 計 算 樣 品 Ｓ１～Ｓ１０ 的 相 似 度，結(jié) 果 依 次 為：０．９７４、０．９７３、０．９７９、０．９８２、０．９９１、 ０．９９１、０．９９４、０．９９２、０．９８８、０．９９１。由此可知，１０批次樣品中 Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０相似度良好，均大于 ０．９８５；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４相似度稍低，均大于０．９７０。來自不同批次ＣＲＳＧ 樣品的 ＵＰＬＣ色譜圖是相似的，各 批次制劑共有成分出峰時間大致相同，成分較穩(wěn)定。

３ 結(jié)論

采 用 ＵＰＬＣ 法 建 立 復(fù) 方 菝 葜 顆 粒 指 紋 圖譜，對各成分進行藥材歸屬，并對主要特征峰進行 指認，通過相似度評價和 ＨＣＡ、ＰＣＡ、ＯＰＬＳ－ＡＤ 等 化學計量學方法考察批次間穩(wěn)定性，尋找造成批次間差異的特征性成分，希望為建立全面可靠的復(fù)方菝葜 顆粒質(zhì)量控制標準提供理論依據(jù)。



 

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