使用超聲波清洗對多指標綜合評價刺五加葉適宜

刺五加葉是五加科植物刺五加 Acanthopanax seuticosus (Rupr. et Maxim.) Harms 的干燥葉片， 臨床研究表明刺五加葉中含有大量對人體有益的 生物活性成分，具有調(diào)節(jié)機體免疫力、預防心腦血 管疾病及改善睡眠等功效。隨著近年來對刺五加 葉的開發(fā)利用不斷增加，刺五加葉顆粒、袋泡茶及 刺五加葉腦欣通等一系列產(chǎn)品相繼推出。但現(xiàn)階 段對刺五加葉的研究多集中于化學成分、藥理作 用以及現(xiàn)代應用等方面，對刺五加葉采收 期的研究鮮有報道，而適宜的采收期是保證刺五加 葉質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。因此，采收期的研究對刺五加 葉的開發(fā)利用具有重要意義。

目前，對刺五加葉適宜采收期研究的考察指標 較單一，難以客觀、全面地反映不同時期刺五加葉 的內(nèi)在品質(zhì)，如陸珞等以紫丁香苷、黃酮類和 多糖為考察指標對刺五加葉的采收期進行了研究。 近年來研究發(fā)現(xiàn)刺五加葉苯丙素類成分含量較高， 并且具有抗炎、抗氧化等作用；原兒茶酸是多種 中藥的活性成分，如益智仁、丹參、芙蓉等，而刺 五加葉中原兒茶酸的研究較少，關于原兒茶酸的藥 理作用已有大量報道，其具有良好的抗氧化和神經(jīng) 保護的作用。因此，本實驗選取苯丙素類的 L苯丙氨酸、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸，黃酮類的 蘆丁、金絲桃苷、槲皮素及原兒茶酸作為考察指標。 此外，產(chǎn)量也是判斷刺五加葉適宜采收期的重要指 標，本實驗測定了刺五加的百葉干質(zhì)量，并與多指 標成分含量測定相結(jié)合進行了綜合評價，確定刺五 加葉的最佳采收期，為刺五加葉的科學采收和合理 利用提供依據(jù)。

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國 Waters 有限公司 2998 PDA 檢測器）；超聲波清洗器（昆山超聲）；電子天平（德國賽多利斯）；H1650臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀 器開發(fā)有限公司）；BGZ-30電熱鼓風干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。 對照品 L-苯丙氨酸（批號 J04J7R8481）、原 兒茶酸（批號 Z30M6L1）、紫丁香苷（批號 P14J7F8937）、綠原酸（批號 Y24J7K16726）、咖 啡酸（批號 Y17D6C7672 ）、 蘆 丁 （ 批 號 Y06J8S37439）、金絲桃苷（批號 Y04A9X62302）、 槲皮素（批號 C20J6Y1722），質(zhì)量分數(shù)均≥98%，均購自上海源葉生物科技有限公司；HPLC 流動 相乙腈為色譜純（J&K Scientific Ltd.公司）；水為 娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其余 試劑均為分析純。 刺五加葉樣品采自黑龍江省哈爾市黑龍江中 醫(yī)藥大學藥用植物園，分別于 2018 年 6 月 3 日 （S1）、2018 年 7 月 3 日（S2）、2018 年 8 月 3 日 （S3）、2018 年 9 月 3 日（S4）、2018 年 10 月 3 日（S5）進行取樣，為保證樣本的代表性，對 10 棵同一年限的固定刺五加植株進行隨機等量取 樣、均勻混合。所有樣品均由黑龍江中醫(yī)藥大學 中藥資源學王振月教授鑒定為五加科植物刺五加 Acanthopanax seuticosus (Rupr. et Maxim.) Harms 的葉。6 月份生長旺盛階段，葉片數(shù)不斷增加， 7 月份進入生殖生長階段，葉片數(shù)不斷增加。8 月末 9 月初葉片數(shù)量不斷減少，10 月份葉片泛 黃脫落。

將不同時期的刺五加葉樣品分別烘干至恒定 質(zhì)量，每個時期分別隨機選取刺五加葉 100 片，重 復 3 次，用電子天平測定質(zhì)量。

采用 Welchrom C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），以乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）；流動 相梯度洗脫，洗脫程序：0～40 min，10%～36.7%A， 進樣體積 20 μL；體積流量 1 mL/min；檢測波長 206 nm；柱溫 30 ℃；在上述條件下，8 種成分與其他 相鄰峰的分離度均大于 1.5，理論塔板數(shù)以各成分 色譜峰計均高于 3 000。色譜圖見圖 1。

精密稱取 L-苯丙氨酸、原 兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲 桃苷、槲皮素對照品適量，加甲醇溶解，配成質(zhì)量 濃度分別為 0.213、0.623、1.025、1.015、0.214、 5.239、5.205、0.211 mg/mL 的對照品溶液，備用。 2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取干燥至恒定質(zhì) 量的樣品粉末（過 60 目篩）1.0 g，置于 10 mL 量 瓶中，加入 10 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，室溫下，超聲 功率 480W，超聲提取 60 min（每 30 分鐘停止 15 min）后取出，放冷用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻， 置于 10 mL 離心管中 4 000 r/min 離心 10 min，吸取 上層清液過 0.22 μm 微孔濾膜，即得。

經(jīng)測定，不同時期刺五加百葉干質(zhì)量動態(tài)變化 情況如圖 2 所示。

由圖 2 可知，刺五加百葉干質(zhì)量在 S1～S5 生 長季節(jié)里呈不斷增長趨勢，在 S1～S2 期迅速增長， S2～S3 期增長減緩，S3 期之后緩慢增長，S5 期刺 五加百葉干質(zhì)量達到最大值。

按照“2.6”項下的方法測定不同時期刺五加葉中8種成分的含量，變化趨勢見圖 3、4。 于同一地點不同時期采收刺五加葉，8 種成分 含量積累變化有差異，其中 L-苯丙氨酸和槲皮素含 量波動變化較小，原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸、 咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷含量變化波動較大。結(jié)合 圖 2、3 進行詳細分析，在 S1 時，除原兒茶酸達到 監(jiān)測全程的含量積累最大值 0.502 7 mg/g 外，其他 5 種成分含量均處于較低水平，但在 S1～S2 期間， 這 5 種成分都處于積累升高狀態(tài)。在 S2 時，除原 兒茶酸含量積累有所下降外，紫丁香苷、綠原酸、 咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷這 5 種成分含量均達到監(jiān) 測全程的最大值，分別 0.649 0、6.376 4、1.137 9、 42.635 7、46.733 4 mg/g。在 S3 至 S5 期間，8 種有效成分含量均呈下降趨勢，以咖啡酸、蘆丁、金絲 桃苷下降較為明顯。在 S5 時，除 L-苯丙氨酸和紫丁 香苷外，其他 6 種有效成分含量均達到監(jiān)測全程的 最小值，分別為 0.115 0、0.657 7、0.330 2、0.399 0、 0.066 4、0.048 9 mg/g。

累總量變化趨勢 從圖 5 可知，不同時期刺五加葉 8 種成分積累 總量（有效成分積累總量＝有效成分總量×百葉質(zhì) 量）整體呈先上升后下降的變化規(guī)律。即在 S1～S2 期間總量總體呈上升趨勢，到 S2 時達到最大，為 1.615 g，S2～S3 期間總量急劇下降，S3～S5 之后 隨著采收時間的推遲，有效成分積累總量（每百葉） 呈明顯下降趨勢。

主成分分析，是考察多個變量間相關性的一種 多元統(tǒng)計方法，通過原始變量中導出少數(shù)幾個主成 分，使它們盡可能多的保留原始變量的信息，且彼此間互不相關，將多個具有相關性指標轉(zhuǎn)換成少數(shù) 幾個互相獨立的綜合指標（即主成分），通過將各 指標得分與其權重結(jié)合進行綜合評分。

4 討論

預試驗對提取溶劑（體積分數(shù)為 50%、75%、 100%甲醇）、提取時間（30、40、60 min）進行了 考察，結(jié)果表明，100%甲醇為最適宜提取刺五加葉 的溶劑，60 min 為最佳提取時間，但為了防止超聲 時間過長產(chǎn)熱，對提取效果有影響，每提取 30 min 時，會停止 15 min。因此選擇 100%甲醇提取 60 min （每 30 分鐘停止 15 min）。 此實驗首次采用HPLC對刺五加葉中L-苯丙氨酸、原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、 金絲桃苷和槲皮素的含量進行了測定，建立方法初 期，首先采用甲醇-水與乙腈-水，分別作為流動相， 結(jié)果表明分離效果均不好，并且難以達到基線分 離，后以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，分離效果 明顯得到改善，但個別峰依舊出現(xiàn)嚴重拖尾現(xiàn)象，故 增加磷酸水溶液為 0.3%，結(jié)果分離效果較為理想。