超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中38種

抗生素主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌性感染類(lèi)疾病，促進(jìn)畜禽健康生長(zhǎng)，以提高養(yǎng)殖質(zhì)量和效率。在 奶牛養(yǎng)殖中，抗生素主要用于治療乳牛乳腺炎、腹瀉等疾病。泌乳期乳牛若過(guò)量使用抗生素或休 藥期不足，可能導(dǎo)致牛奶中殘留抗生素，并通過(guò)食物鏈對(duì)人體健康造成不良影響，如引起胃腸不適、 過(guò)敏反應(yīng)、肝功能損害等。此外，濫用抗生素或長(zhǎng)期攝入含抗生素食品可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥 性，對(duì)人類(lèi)健康危害更加嚴(yán)重，同時(shí)，抗生素殘留對(duì)環(huán)境中微生物群落也會(huì)產(chǎn)生影響，并通過(guò)食 物鏈影響高級(jí)生物，破壞生態(tài)系統(tǒng)。為保障食品安全，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第 235 號(hào)公告規(guī)定了動(dòng)物源性食 品中抗生素的最大殘留限量( MＲL) ，許多國(guó)家及組織也制定了抗生素最大殘留限量，限量標(biāo)準(zhǔn)日益 嚴(yán)格。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的食品中抗生素檢測(cè)方法十分必要。 目前，抗生素的檢測(cè)方法主要有微生物法、生 物 傳 感 法、酶 聯(lián) 免 疫 法、液 相 色 譜 法、液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜法等。但微生物法、生物傳感法及酶聯(lián)免疫法的特異性不高，靈 敏度較差; 液相色譜法存在檢測(cè)抗生素種類(lèi)有限、檢出限高等缺點(diǎn)。超高效液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜法 ( UPLC － MS /MS) 因分析效率高、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，成為抗生素殘留分析的主流檢測(cè)方法。王浩等利用液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜在 30 min 內(nèi)測(cè)定了牛奶中 5 類(lèi) 35 種抗生素殘留，李寧等開(kāi)發(fā)了牛奶中 4 類(lèi) 25 種抗生素殘留的檢測(cè)方法。但已有方法存在操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、檢測(cè)抗生素種類(lèi)或數(shù)量相對(duì)較 少，以及不適于樣品快速篩查分析的不足。抗生素殘留問(wèn)題日漸突出，由此帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)引起了社 會(huì)公眾廣泛關(guān)注，為確保我國(guó)食品和環(huán)境安全，探索一種快速、高效、靈敏的多種類(lèi)抗生素殘留同時(shí) 測(cè)定方法迫在眉睫。 本文以奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常用的抗生素為研究對(duì)象，針對(duì)不同種類(lèi)抗生素理化性質(zhì)的差異，優(yōu)化了提 取溶劑和凈化條件，考察了基質(zhì)效應(yīng)，建立了同時(shí)測(cè)定牛奶中 5 類(lèi)( 磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯 霉素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)) 38 種抗生素殘留的 UPLC － MS /MS 方法。本方法成功應(yīng)用于實(shí)際牛奶樣品中目 標(biāo)抗生素的測(cè)定，可為牛奶中多類(lèi)別、多組分抗生素的快速篩查提供參考。

Waters Acquity UPLC H － Class Xevo TQ － S 超高效液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜儀( 美國(guó) Waters 公司) ; 渦 旋振蕩器( 德國(guó) IKA 公司) ; HGC － 36A 氮吹儀( 天津恒奧有限公司) ; KQ-500DE 超聲儀( 昆山市超聲儀器有限公司) ; Anke TDL － 5 － D 離心機(jī)( 上海安亭科學(xué)儀器廠) ; Milli-Q 超純水器( 美國(guó) Millipore 公 司) 。 甲醇、乙腈( 均為 HPLC 級(jí)，德國(guó) Merck 公司) ; 甲酸( HPLC 級(jí)，上海麥克林公司) ; Oasis PＲiME HLB( 60 mg，3mL) 固相萃取小柱( 美國(guó) Waters 公司) ; 磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲 唑、 磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺異 唑、磺胺苯酰、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠 嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺喹 啉、磺胺間二甲氧嘧啶、丹諾沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環(huán) 丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奧比沙星、雙氟沙星、 喹酸、氟甲喹、四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素、金霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、羅 紅霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于德國(guó) Dr. Ehrenstorfer 公司，純度均≥98% 。

準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，分別用甲醇溶解并定容至 10 mL，配制成質(zhì)量濃度均為 1 mg /mL 的單 標(biāo)儲(chǔ)備液; 量取各單標(biāo)儲(chǔ)備液 0. 1 mL 至同一 10 mL 容量瓶中，以甲醇定容并混勻，配制成質(zhì)量濃度為 10 μg /mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于 － 20 ℃ 下密閉保存。準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制 成系列空白樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

準(zhǔn)確稱(chēng)取 1. 00 g 牛奶樣品至 15 mL 聚丙烯離心管中，加入 5 mL 0. 5% ( 體積分?jǐn)?shù)) 甲酸乙腈溶液， 渦旋振蕩后超聲 10 min，以 5 000 r/min 離心 5 min，取上清液，待凈化。 Oasis PＲiME HLB 固相萃取小柱經(jīng) 5 mL 乙腈 － 水溶液( 體積比 1 ∶ 1) 活化平衡后，上樣，流速為 1 mL /min，用 5 mL 乙腈 － 水溶液( 1 ∶ 1) 洗脫，收集流出液，在 40 ℃下氮吹近干，用初始流動(dòng)相溶解并定容至 1 mL，過(guò) 0. 22 μm 濾膜后，待 UPLC － MS /MS 分析。

色譜條件: Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱( 100 mm × 2. 1 mm i. d. ，1. 8 μm) ; 流速: 0. 4 mL / min; 柱溫: 40 ℃ ; 進(jìn)樣量: 2 μL; 流動(dòng)相: A 為 0. 1% ( 體積分?jǐn)?shù)) 甲酸水溶液，B 為甲醇。梯度洗脫 程序: 0 ～ 0. 20 min，95% A; 0. 20 ～ 2. 50 min，95% ～ 50% A; 2. 50 ～ 4. 50 min，50% ～ 5% A; 4. 50 ～ 4. 51 min，5%～ 95% A; 4. 51 ～ 8. 00 min，95% A。 質(zhì)譜條件: 電噴霧離子源( ESI) ; 待測(cè)磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素為正離子 模式，毛細(xì)管電壓: 2. 5 kV; 氯霉素類(lèi)抗生素為負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓: － 2. 5 kV; 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模 式( MＲM) 檢測(cè); 離子源溫度: 150 ℃ ; 脫溶劑溫度: 600 ℃ ; 脫溶劑氣和錐孔氣均為氮?dú)猓魉俜謩e 為 1 000、150 L /h; 碰撞氣為氬氣( 純度 ＞ 99. 999% ) ，流速為 0. 15 mL /min。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表 1。

5 類(lèi)抗生素在不同離子模式下的響應(yīng)不同，磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在 正離子模式下響應(yīng)較強(qiáng)，而氯霉素類(lèi)在負(fù)離子模式下響應(yīng)較強(qiáng)。因此，本研究選擇正、負(fù)離子模式同 時(shí)監(jiān)測(cè)以提高效率。 考察了 Acquity UPLC HSS T3 色譜柱( 100 mm × 2. 1 mm i. d． ，1. 8 μm) 和 Acquity UPLC BEH C18色 譜柱( 100 mm × 2. 1 mm i. d． ，1. 7 μm) 對(duì) 38 種抗生素的分離效果。結(jié)果顯示，經(jīng) Acquity UPLC HSS T3 色譜柱分離后 38 種抗生素的峰形相對(duì)更佳，這是由于 HSS T3 柱為硅膠基質(zhì)色譜柱，適用于較寬極性 范圍的物質(zhì)分析，對(duì)于同時(shí)分析多種目標(biāo)物的效果相對(duì)較佳。 通過(guò)質(zhì)譜掃描分析，分別對(duì)各抗生素進(jìn)行正離子、負(fù)離子掃描，確定各目標(biāo)物的分子離子，再對(duì) 分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描( 子離子掃描) ，對(duì)錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇響應(yīng)強(qiáng)度較 高的子離子為特征離子。設(shè)定駐留時(shí)間及采集通道，確保色譜峰采集點(diǎn)數(shù)在 12 點(diǎn)以上，以得到準(zhǔn)確的 定量結(jié)果。各抗生素的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表 1。

3 結(jié) 論

本研究建立了 UPLC － MS /MS 同時(shí)測(cè)定牛奶中 5 類(lèi)( 磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)和大 環(huán)內(nèi)酯類(lèi)) 38 種抗生素殘留的分析方法，對(duì)提取溶劑、凈化方式等因素進(jìn)行了優(yōu)化。在最佳條件下， 38 種抗生素在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，LOQ 為 0. 10 ～ 1. 0 μg /kg，在低、中、高 3 個(gè)加 標(biāo)水平下的平均回收率為 70. 7%～ 94. 9% ，ＲSD 為 4. 0% ～ 9. 4% ，各指標(biāo)均滿足分析檢測(cè)的要求。該 方法對(duì)于牛奶中多類(lèi)別、多組分抗生素殘留的分析監(jiān)測(cè)、快速篩查具有參考意義。